Desenvolvimento de uma plataforma de metilação de DNA in vivo para transformação de Clostridium acetobutylicum

Abstract

Bactérias pertencentes à espécie Clostridium acetobutylicum têm sido amplamente utilizadas para a produção de solventes por realizarem um processo fermentativo conhecido como fermentação ABE (Acetone/Butanol /Ethanol). Através desta via, este micro-organismo é capaz de produzir acetona, butanol e etanol a partir de carboidratos simples. Dessa forma, C. acetobutylicum é considerado um micro-organismo promissor na produção de bioálcoois, sobretudo, de butanol em escala industrial. Diferentes cepas de C. acetobutylicum já foram estudadas e exibiram capacidade de produzir solventes, no entanto, bactérias deste gênero apresentam resistência à manipulação genética decorrente de um sistema endógeno de restrição capaz de clivar sequências de DNA não metilado, impedindo o melhoramento genético desses organismos. O presente estudo teve o objetivo de desenvolver uma cepa de Escherichia coli expressando a metiltransferase φ3Ti-MTP, isolada do fago ϕ3T de Bacillus subtillis, que se mostrou eficiente para a proteção de sequências de DNA contra a ação do sistema de restrição de C. acetobutylicum. Para tanto, foram utilizados como estratégia de edição genômica o sistema CRISPR/Cas9 e o sistema de reparo por HDR (Homology Direct Repair) de E. coli com o objetivo de integrar o gene φ3Ti expressando a metiltransferase no genoma de E. coli. As cepas mutantes foram confirmadas por PCR do fragmento integrado ao DNA genômico de E. coli e a funcionalidade de φ3Ti in vitro foi confirmada pela digestão de vetores previamente introduzidos em células mutadas de E. coli com a enzima SatI, isoesquizômero da enzima de restrição Cac824I, presente no sistema de restrição de C. acetobutylicum. Em seguida a capacidade de metilação e proteção de material plasmidial desses clones foi avaliada in vivo pela transformação de C. acetobutylicum com vetores previamente submetidos aos clones de E. coli. Finalmente, uma técnica de PCR com princípio semelhante ao da TAIL-PCR e o subsequente sequenciamento das regiões amplificadas foram utilizados como estratégia para determinar o local aproximado de integração do gene Φ3Tim. Os resultados obtidos mostraram que o gene φ3Ti foi integrado e expresso com sucesso em E. coli, gerando uma plataforma universal de metilação com a finalidade de permitir a manipulação genética de C. acetobutylicum.