Estudo do exportoma de Plasmodium falciparum nos estágios eritrocitários tardios

Abstract

A malária é considerada a parasitose mais grave e o Plasmodium falciparum é a espécie responsável pelo maior número de mortes. O desenvolvimento de novos fármacos requer o conhecimento da biologia do parasito, das suas proteínas essenciais e de como elas interagem entre si. O P. falciparum exporta proteínas para a célula hospedeira que desempenham funções essenciais para o parasito e esse exportoma pode conter alvos moleculares para o desenho de novas drogas e de vacinas. Esse trabalho buscou testar estratégias inovadoras para o estudo do exportoma. A primeira estratégia otimizada foi o subfracionamento do exportoma por lise seletiva com estreptolisina O (toxina que lisa seletivamente a membrana do eritrócito) seguida de centrifugação. Na fração enriquecida de conteúdo membranar e periférico, foram identificadas proteínas conhecidas do exportoma e não se observou a presença de proteínas da membrana do vacúolo parasitóforo, o que reforça e especificidade da lise. As análises de ontologia genética demonstraram um enriquecimento de proteínas exportadas e de membrana nessa fração. Também foram identificadas muitas proteínas envolvidas com a síntese proteica, associadas ao DNA, relacionadas ao metabolismo, do citoesqueleto e chaperonas. A identificação da PfPDI-8, proteína descrita como uma chaperona que preserva as estruturas moleculares corretas de outras proteínas, na fração membranar da hemácia suscitou que ela provavelmente auxilia as proteínas recém-exportadas. Assim a presença da PfPDI-8 foi validada por western blotting e suas parceiras foram estudadas por BN-BLOT (BN-PAGE acoplado a western blotting). Observou-se que, a partir de um extrato de parasitos, a PfPDI-8 foi identificada na mesma banda que uma proteína também conhecida do retículo endoplasmático, a BIP. A segunda técnica inovadora testada foi a biotinilação de proteínas pela peroxidase de ascorbato 2 (APEX2). As condições de expressão e purificação da proteína recombinante foram definidas. As análises por western blotting demonstraram que apenas a condição que continha todos componentes da reação (APEX2, H2O2 e biotina fenol) demonstrou marcação pela estreptavidina-HRP. Esse resultado indica a possibilidade de utilização da marcação de proteínas de superfície pela APEX2, porém essa técnica ainda requer otimizações antes de ser utilizada para esse fim. As abordagens testadas nesse estudo contribuíram para um maior conhecimento do exportoma do P. falciparum.