Toxinas Cry : potencial uso no controle da broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus)

Abstract

No Brasil, a cultura da cana-de-açúcar (Saccharum qfficinarum L.) possui grande destaque, com aproximadamente 40% da produção mundial. Apresenta estimativa de produção de 571.471,0 milhões de toneladas para a safra 2011/2012, sendo uma alternativa interessante e ecologicamente correta para a produção de fontes de energia renováveis. Embora o Brasil esteja classificado entre os líderes mundiais na produção de cana-de-açúcar, regiões como o Nordeste e o Sudeste apresentam problemas econômicos relacionados a danos causados pelo ataque de insetos-praga, destacando-se a broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus) (Lep.: Castniidae) e a broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) (Lep.: Crambidae), respectivamente. A dificuldade no controle dessas pragas está no fato de possuírem hábito endofítico, que impede a ação dos inseticidas químicos. Neste contexto, várias proteínas entomotóxicas têm sido descritas como potenciais candidatas para o controle de insetos-praga. As toxinas Cry ou ô-endotoxinas, secretadas pela bactéria gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt), são moléculas efetivamente usadas no controle de insetos-praga, devido a sua especificidade e toxicidade a algumas ordens de insetos. Nesse trabalho, o objetivo é selecionar toxinas Cry eficazes contra T. I. licus, aplicando as técnicas de DNA shufjling e Phage display. Resultados de bioensaios utilizando cepas de Bt (Bt sor. kurstaki S2195 e S1905 e Bt sor. tolworthi S135 e S62) e larvas de Io instar de T. I. licus indicaram alta mortalidade nos tratamentos com Bt sor. kurstaki. Os genes cry presentes nessa sorovariedade de Bt foram determinados e ensaios de dilatação osmótica baseados em espalhamento de luz, indicaram que as toxinas CrylAa, CrylAb, Cryl Ac, Cryllal2 e Cry2Aa foram capazes de formar poros nas BBMVs de T. I. licus. Em bioensaios contendo tratamentos com as mesmas toxinas Cry (1 mg/mL) e larvas de T. I. licus foi demonstrada efetividade, com taxa de mortalidade de aproximadamente 90%. Visando a obtenção de novas moléculas de genes cry através da técnica de evolução molecular in vitro (DNA shuffling), a análise de seqüências nucleotídicas entre os genes crylAa, crylla!2 e cry2Aa foi realizada e os dois primeiros genes foram escolhidos para serem recombinados por essa técnica, pois apresentam maior identidade nucleotídica. Após o DNA shuffling, foi obtida uma biblioteca combinatória contendo 1,36 x 106 genes crylAa e cryllal2 variantes. Antes de iniciar a seleção das variantes Cry utilizando Phage display (biopanning), os receptores presentes nas membranas do intestino (BBMVs) das larvas de broca gigante da cana-de-açúcar foram testados quanto a sua qualidade e apresentaram um enriquecimento de 7,0 a 13,5 vezes em relação às enzimas marcadoras testadas. Foram selecionados cinco genes cry variantes mostrando afinidade às BBMVs de T. I. licus. Estes foram expressos em E. coli e as proteínas validadas por bioensaios e em ensaios de ligação às BBMVs. Foram identificadas duas toxinas Cry 1 Ia 12 variantes com aumento na atividade entomotóxica de 2,5 a 3,5 vezes, comparado com a toxina selvagem, além da atividade da toxina Cry2Aa demonstrada ser efetiva contra o inseto-praga em questão; atividades entomotóxicas essas sujeitas à proteção sob a forma de patente. Os resultados aqui apresentados serão utilizados para a construção de vetores de expressão em plantas para uso na transformação genética de cana-de-açúcar, visando a resistência à broca gigante da cana-de-açúcar.