Estrutura cristalográfica e atividade dos peptídeos derivados do inibidor de proteases de Vigna unguiculata em complexo com tripsina

Abstract

Inibidores naturais foram classificados em várias famílias diferentes, entre elas destaca-se a classe de inibidores Bowman-Birk Inhibitor (BBI). BBI são moléculas de baixa massa molecular e apresentam alto conteúdo de cisteína. Além de suas funções biológicas, alguns inibidores da família BBI têm sido descritos como agentes supressores de carcinogênese em vários órgãos e tecidos. Um inibidor BBI extraído de Vigna unguiculata denominado Black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor (BTCI) foi caracterizado estruturalmente e bioquimicamente. O BTCI apresenta dois loops reativos que interagem com tripsina e quimotripsina simultaneamente, por meio dos aminoácidos Lys26 para inibição de tripsina e Phe53 para inibição de quimotripsina. Estruturas dos complexos foram depositadas no Protein Data Bank (PDB). Uma análise estrutural dos complexos mostrou a presença de um loop inibitório formado pela ligação de dissulfeto entre os resíduos Cys24 e Cys32 do BTCI. No presente estudo investigamos estruturalmente e funcionalmente os peptídeos sintéticos derivados dos loops inibitórios do BTCI. Foram desenhados variações dos peptídeos sintéticos (ptryp9, ptryp8, ptryp7 e ptryp6) para os estudos propostos. Neste estudo apresentamos a correlação entre ensaios de inibição e as estruturas cristalográficas dos peptídeos sintéticos derivados do BTCI. Vários cristais foram obtidos em diferentes condições dos complexos entre os peptídeos sintéticos e a enzima. Os cristais foram expostos em diferentes comprimentos de onda e seus padrões de difração medidos na linha MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS, Campinas, Brasil). O ptryp9 foi resolvido em dois grupos espaciais, ptryp8 em um grupo espacial, ptryp7 em dois grupos espaciais e o ptryp6 em um grupo espacial utilizando o método de substituição molecular para a busca inicial das fases. Ao final foram resolvidas 6 estruturas diferentes construídas e refinadas utilizando pacotes computacionais. Os valores de Rfree e Rwork foram monitorados ciclos após ciclos. Os ensaios de atividade dos peptídeos sintéticos demonstraram diferentes níveis de inibição, sendo o ptryp9 melhor em comparação com os demais. As estruturas cristalográficas dos peptídeos reduzidos mostram mudanças estruturais ocasionados pela redução dos peptídeos propostas apoiando uma hipótese que a redução de sequência altera a atividade desses peptídeos.