Caracterização de mutantes de Trypanosoma cruzi deficientes em dipeptidil peptidase 8 e produção de anticorpos contra proteínas ligadoras de RNA (UBP1Tc e UBP2Tc)

Abstract

A doença de Chagas é uma patologia crônica, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, endêmica em países da América Latina. Entretanto, possui impacto mundial uma vez que estudos econômicos indicam um custo de 7,2 bilhões de dólares por ano associado a doença. O medicamento disponível para seu combate, benzonidazol, apresenta baixa eficácia em fase crônica e a grande complexidade biológica do organismo dificulta o desenvolvimento de novos fármacos. Portanto, se faz necessário o melhor entendimento do tripanossomatídeo, assim como das moléculas envolvidas nos seus processos celulares. Nesse aspecto se sobressaem a dipeptidil peptidase 8 (DPP8Tc), que ainda não possui sua função biológica conhecida, mas apresenta homólogos com papel importante em diversas patologias, e as proteínas ligadoras de RNA (UBP1Tc e UBP2Tc), por sua atuação na regulação da expressão gênica. O presente trabalho almejou contribuir com a elucidação da função da DPP8Tc e produzir ferramentas para estudos posteriores sobre as RPBs. Linhagens de T. cruzi simples nocaute para o gene dpp8tc foram caracterizadas, sendo observado uma diminuição na taxa de metaciclogênese do clone F9, que apresentou a menor expressão da proteína vista por western blot e imunofluorescência. Ensaios de metabolômica mostraram uma maior produção de prolina intracelular no clone C8, e o estudo da expressão de outras proteases permitiu se constatar uma superexpressão de enzimas da mesma família (POPTc80, OPBTc) nos mutantes simples. Além disso, as formas tripomastigotas metacíclicas selvagens apresentaram menor expressão da DPP8Tc em relação as formas epimastigotas. Em conjunto, esses dados indicam um possível papel dessa enzima no processo de diferenciação. A tentativa de duplo nocaute foi realizada por meio da técnica de CRISPR-Cas9, ainda que este não pôde ser confirmado. Ademais, as RBPs, UBP1Tc e UBP2Tc foram expressas de forma heteróloga, e anticorpos policlonais foram produzidos para essas proteínas. Esses anticorpos serão importantes ferramentas de validação para estudos proteômicos da interação entre RBPs e RNAs.