Purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos isolados da secreção cutânea do anuro Boana lundii (Burmeister, 1856)

Abstract

O aumento da resistência de microrganismos patogênicos aos antibióticos disponíveis promoveu uma busca por novas alternativas terapêuticas para superar os mecanismos de resistência. Essa resistência é causada pelo uso indiscriminado de agentes antimicrobianos, pois podem favorecer linhagens de microrganismos resistentes. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) atuam com um mecanismo de ação diferenciado, podendo ser utilizado diretamente ou inspirar o desenho de novas drogas para que possam ser aplicadas como novas alternativas terapêuticas para combater a resistência antimicrobiana. O presente estudo teve como objetivo geral realizar a identificação, o isolamento e a caracterização química e biológica de peptídeos antimicrobianos inéditos presentes na secreção cutânea do anuro Boana lundii (Anura: Hylidae). Indivíduos adultos de B. lundii foram coletados no município de Monte Alegre de Goiás (GO) e a secreção cutânea foi obtida por estimulação elétrica moderada, liofilizada e armazenada a −20°C. Alíquotas da secreção seca foram fracionadas por RP-HPLC em coluna C18 column (Vydac 218TP54; 4,6 x 250 mm) usando gradiente linear de 0,1 % (v/v) TFA em acetonitrila, com fluxo de 1,0 mL/min. As frações eluidas foram monitoradas a 216 nm, coletadas manualmente e secas. Em seguida, foram realizados ensaios de varredura com as bactérias patogências Escherichia coli e Staphylococcus aureus para detecção das frações capazes de promover a inibição do crescimento microbiano. As frações com atividade inibitória sobre as bactérias utilizadas foram submetidas à análise por MALDI-TOF MS, permitindo a identificação de três peptídeos. Na fração 28 observou-se a presença de um componente principal de massa molecular igual a 2723,74 Da; na fração 29 detectou-se um componente com massa molecular igual a 1835,02 Da e na fração 30 outro peptídeo com massa molecular de 1879,05 Da. As estruturas primárias dos três peptídeos foram determinadas empregando-se degradação de Edman automatizada. O peptídeo oriundo da fração 28 (com cadeia polipeptídica de 27 resíduos de aminoácidos) foi denominado raniseptina-Bl 1 e exibiu similaridade com o peptídeo raniseptina 3 isolado da secreção do anuro B. raniceps. Tal peptídeo exibiu atividade antimicrobiana relevante sobre bactérias e fungos patogênicos, merecendo destaque seus efeitos sobre as bactérias S. epidermidis com CMI < 1 μM e sobre K. pneumoniae com valor de CMI = 2 μM. Também mostrou-se bem ativo sobre os fungos C. neoformans (CMI = 4 μM) e C. albicans (CMI = 16 μM). Outros dois peptídeos pertencentes à família das hilinas também foram isolados e caracterizados no presente trabalho. Tais peptídeos, denominados hilinas b3 e b4, mostraram-se mais ativos sobre as bactérias Gram-positivas do que sobre as Gram-negativas. A hilina b3 mostrou-se a mais ativa dentre as duas novas hilinas isoladas, merecendo destaque sua atividade sobre as bactérias Gram-positivas S. aureus e S. epidermidis com valores de CMI iguais a 8 μM e sobre o fungo C. neoformans com valor de CMI igual a 16 μM. Os três peptídeos exibiram atividade inibitória parcial sobre a proliferação do parasita T. cruzi, sendo que nenhum dos peptídeos testados conseguiu inibir completamente a proliferação do parasita mesmo na maior concentração empregada (128 μM). Os três peptídeos adotaram conformação em α-hélice na presença de micelas de SDS, ambiente que mimetiza a membrana plasmática de microrganismos. O presente estudo reforça o potencial terapêutico dos PAMs isolados da secreção cutânea de anuros e evidencia a necessidade de estudos sistemáticos visando explorar adequadamente o potencial farmacológico e bioquímico da anurofauna brasileira.