Indução de morte celular imunogênica por terapia fotodinâmica mediada por cloreto de alumínio-ftalocianina incorporado a nanoemulsão em células de câncer de mama murino

Abstract

A nanobiotecnologia, que aplica técnicas, princípios biológicos e nanotecnológicos para melhorar a compreensão e transformação dos biossistemas, é oferecida como proposta de inovação tecnológica para tratamento do câncer. Dentre os avanços da nanobiotecnologia nos diversos setores do campo da saúde, destacam-se aqueles aplicados à terapia fotodinâmica (TFD), modalidade terapêutica minimamente invasiva e cujo uso é clinicamente aprovado para o tratamento de diferentes tipos de doenças oncológicas e não oncológicas. A TFD é capaz não apenas de destruir o tumor devido à sua toxicidade direta às células cancerosas, mas também de causar infarto do tecido canceroso por destruir a microvasculatura tumoral, bem como por ativar o sistema imunitário contra antígenos tumorais. Diante disso, o objetivo principal deste estudo foi avaliar a indução de morte celular imunogênica (MCI) causada pela TFD mediada por nanoemulsão com cloreto de alumínio-ftalocianina (TFD-NE-AlFtCl) em células de câncer de mama murino in vitro e in vivo. Para tanto, foi realizada a produção de um novo lote da NE-AlFtCl, que foi caracterizado e teve a estabilidade para suas prorpiedades coloidais, fotofísicas e físico-química avaliada. Concomitantemente aos testes de estabilidade, a NE-AlFtCL foi utilizada para avaliação do perfil de internalização pelas células 4T1, bem como para a avaliação de qual via de endocitose estava sendo utilizada para internalização, além da investigação de sua colocalização subcelular. Após a avaliação dos perfis de internalização, da via endocítica e da colocalização, as células 4T1 foram submetidas a diferentes protocolos da TFD-NE-AlFtCl, variando os tempos e doses de energia (J/cm²). As células 4T1 foram avaliadas quanto à via de morte desencadeada pela exposição a TFD-NE-AlFtCl. Foi verificada também a emissão de padrões moleculares associados a dano (DAMP) —HSP70, HSP90, Calreticulina, HMGB1 e IL-1β—, fator-chave para a indução de morte celular imunogênica (MCI). Por fim, após a avaliação dos perfis de liberação desses DAMP, as células pré-tratadas com TFD-NE-AlFtCl foram utilizadas como vacina em camundongos da espécie Balb-C a fim de verificar a ativação de uma resposta antitumoral. Para tanto, após as vacinações, os animais foram submetidos ao enxerto de células 4T1 viáveis, e monitorados quanto ao surgimento de tumor, volume tumoral e sobrevida durante todo experimento. O tempo de 15 minutos foi suficiente para identificação do FS AlFtCl dentro das células 4T1 e essa internalização foi dependente de caveolinas. Os resultados obtidos quanto à internalização e à colocalização subcelular do FS AlFtCl nas organelas núcleo, lisossomos, mitocôndrias e no retículo endoplasmático (RE) demonstraram diferenças na retenção do FS AlFtCl. Sendo que, os tempos de 15, 30 e 45 minutos apresentaram uma maior quantidade de FS AlFtCl nas organelas supracitadas, quando comparados como os tempos de 60, 120 e 240 minutos. Os diferentes protocolos da TFD-NE-AlFtCl aplicados nas células foram eficazes quanto à diminuição da viabilidade das células 4T1. Vale ressaltar ainda que à medida em que o tempo e a dose de energia foram variados, houve variação do perfil de morte e da via de morte ocasionada (apoptose/necrose). Os tratamentos com TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² apresentaram maior perfil de apoptose, o que refletiu numa maior emissão de DAMP: HSP70, HSP90, Calreticulina, HMGB1 e IL-1β, quando comparados com os demais protocolos. Esses resultados apresentados pelo tratamento com TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² se refletiram também, na avaliação in vivo, sendo verificada uma maior resistência dos animais quanto ao surgimento do tumor, a apresentação de menores volumes tumorais e maior sobrevida. Contudo, o presente estudo conclui que os diferentes protocolos de TFD-NE-AlFtCl aplicados às células 4T1 foram capazes de fazer a emissão dos DAMP — sendo esse requisito chave para ação de uma ativação de MCI e uma ativação antitumoral — porém, essas emissões ocorreram de formas diferentes mediante as alterações de tempo de dose de energia. Conclui-se também que a aplicação da TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² mais branda demonstrou melhores resultados quanto ao surgimento e desenvolvimento do tumor, além de apresentaremm uma maior taxa de sobrevida.