Norovírus humano GII.4-Sydney : caracterização molecular e desenvolvimento de clone infeccioso e replicon

Abstract

Norovírus humano (HuNoV) é uma das principais causas de gastroenterite aguda no mundo sendo responsável por mais de 20% de casos. Esta alta incidência concentrou a atenção para as estratégias de prevenção, especialmente no entendimento da epidemiologia molecular dos norovirus (HuNoV) e para a melhor compreensão dos mecanismos de replicação dos norovirus. Por isso, a genética reversa de HuNoV pode ser uma ferramenta útil para elucidar os processos de infecção viral e mecanismo de replicação. Esse estudo propõe a análise de sequenciamento genômico, desenvolvimento do clone infeccioso e replicon, estudar a localização intracelular da Helicase e RdRp viral. Nesse trabalho foi desenvolvido um método rápido de construção de um clone de cDNA infeccioso de HuNoV usando a técnica Gibson Assembly. Dois genomas de dois isolados HuNoV-393 e HuNoV-666 foram clonados em pCR4-Topo e sequenciados. O relacionamento filogenético baseado nos genes da RNA polimerase (RdRP) e capsídeo (VP1) foram comparativamente analisados com as variantes de GII.4. O genoma completo de HuNoV-393 (GII.4 subtipo Sydney) foi clonado no vetor plasmidial pcDNA 3.1 previamente modificado. Para monitorar a replicação viral in vitro, o gene repórter da proteína fluorescente verde (GFP) foi fusionado nas posições entre os genes Helicase e p22 também por Gibson Assembly para construir o replicon pHuNoV-GFP. As células humanas Caco-2 foram transfectadas com o clone infeccioso contendo cDNA genômico completo e replicon com GFP. A detecção de VP1 em células transfectadas mostraram a evidência indireta da replicação de HuNoV. Desta forma, o clone infeccioso e replicon com GFP para o HuNoV GII.4 subtipo Sydney, constitui uma ferramenta valiosa para o estudo de replicação dos norovírus humano. Nesta tese foi iniciado o estudo dos sítios de replicação do HuNoV por meio do estudo dos genes Helicase e RdRp. Nesse trabalho optamos por clonar os genes Helicase e RdRp em ambas posições N e C-terminal do gene reporter GFP, porém não observamos diferenças de expressão significativa entre as construções RdRp-C e RdRp N-terminal, e com Helicase-N foi observado uma baixa expressão. Experimentos adicionais serão necessários para confirmar a localização das proteínas Helicase e RdRp.