Genotipagem de polimorfismos de um único nucleotídeo diretamente no soro por qPCR alelo-específico usando “amplicons” de tamanho reduzido

Abstract

A importância clínica em genotipar polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) está relacionada na avaliação da suscetibilidade genética no desenvolvimento de doenças e possui foco na medicina preventiva e personalizada. Sabemos que a concentração de DNA genômico livre de células no soro é relativamente alta. Assim, neste estudo, pretendemos estimar a quantidade e avaliar o tamanho de DNA genômico livre de células no soro, testar se o soro cru (sem extração de DNA) poderia ser usado diretamente como fonte de DNA para qPCR e investigar se polimorfismos poderiam ser genotipados diretamente do soro cru isolado do sangue capilar usando uma centrífuga de papel operada pela força das mãos. Observou-se que alvos genômicos de tamanhos variados (65, 101, 202 e 688 pares de bases) poderiam ser amplificados com sucesso a partir do DNA extraído do soro, e que a quantidade de DNA genômico aumenta no soro com sua incubação na presença do coágulo à temperatura ambiente. Ademais, apenas os alvos genômicos de 65 e 101 pares de bases puderam ser amplificados a partir de soro cru (sem extração de DNA). A incubação por 4 dias à temperatura ambiente foi necessária para a amplificação de alvos maiores que 101 pares de bases. Em relação a genotipagem de SNPs, o soro foi separado com sucesso do sangue capilar usando uma centrífuga de papel e os genótipos foram atribuídos testando o soro cru, usando ARMS-qPCR com amplicons de tamanhos pequenos, que estavam totalmente de acordo com os genótipos atribuídos testando o DNA extraído do sangue capilar. Assim, o soro pode ser usado diretamente como “template” para reações de qPCR simplificando a fase pré-analítica e eliminando a etapa de extração na genotipagem de SNPs. Esses atalhos no processo podem futuramente promover diagnóstico molecular por teste laboratorial remoto (“point-of-care”).