Expressão heteróloga de proteínas de C. thermocellum e montagem de celulossomas “in vitro” visando aplicação biotecnológica

Abstract

O presente trabalho tem como objetivo clonar e expressar os genes da endo-xilanase xyn10D, endoglucanase celJ e mini-CipA (contendo dois módulos de coesinas), codificadores de proteínas celulossomais de Clostridium thermocellum para montagem de celulossomas “in vitro”. Os genes endoglucanase celJ e da endo-xilanase xyn10D foram expressos em Pichia pastoris (Komagataella phaffii) da linhagem GS115 sob o controle do promotor induzível AOX1. O clone pPIC9-CelJ/A-1 apresentou atividade de CMCase nas primeiras 24 horas de crescimento, sendo os maiores níveis encontrados após 72 horas. A atividade xilanolítica do clone pPIC9-Xyn10D*-3 também foi detectada nas primeiras 24 horas de cultivo e o maior valor de atividade foi detectado após 96 horas. A endo-xilanase Xyn10D* foi parcialmente purificada após dois passos cromatográficos, troca iônica (QFF) e exclusão molecular (S200) e caracterizada. A Xyn10D* apresentou atividade máxima a 65°C, pH 6,0, e estabilidade térmica a 50°C ,60°C e 70°C. Dos compostos fenólicos avaliados, apenas o ácido tânico inibiu a atividade da enzima. Quanto ao experimento de sacarificação, a Xyn10D* parcialmente purificada, hidrolisou o bagaço de cana de açúcar pré-tratado, mostrando um aumento gradual na liberação de açúcar ao longo do tempo, e a maior quantidade de açúcar redutor foi detectada após 72 horas. O gene da proteína estrutural mini-CipA, foi expresso em Escherichia coli BL21(DE3). Esta proteína foi purificada após dois passos cromatográficos; cromatografia de afinidade e troca iônica (QFF). De acordo com a análise de montagem dos mini-celussomas foi possível notar que em todas as proporções molares testadas de “ΔCipA/Xyn10D* houve associação entre estas proteínas e possivelmente a formação do complexo mini-CipA-Xyn10D*. No entanto, mais experimentos serão necessários para confirmar este resultado. Estudos adicionais sobre a atividade enzimática da Xyn10D* associada a proteína estrutural serão avaliados e comparados com os resultados obtidos com a proteína livre.