Variabilidade e tolerância ao cobre em Xanthomonas campestris pv. viticola, agente causal do cancro bacteriano da videira (Vitis spp.)

Abstract

O cultivo de uvas de mesa no Brasil tem se intensificado principalmente em áreas próximas ao Submédio do Vale do São Francisco. Essa região é responsável por 15 % da produção de uvas de mesa finas do país, correspondendo a cerca de 98 % das exportações brasileiras anuais de uva, tanto em volume quanto em valores de produção. Entretanto, muitos são os problemas fitossanitários que ocorrem nessa cultura. Dentre as doenças de etiologia bacteriana apenas o cancro bacteriano, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), apresenta hoje incidência expressiva e importância econômica em videira. Embora tenha sido relatada em 1998, acredita-se que a bacteriose já estivesse presente na região desde 1996, sem ter sido detectada. Assim torna-se importante monitorar a variabilidade das populações bacterianas ao longo dos anos, o que pode ser conseguido de maneira eficiente utilizando marcadores moleculares. Outro fator a ser considerado é o uso contínuo e muitas vezes indiscriminado de compostos cúpricos na agricultura o que pode levar a ocorrência de bactérias fitopatogênicas ou saprofíticas resistentes ao cobre. Considerando a importância do cancro bacteriano para a viticultura no Brasil e buscando maior conhecimento sobre variabilidade do patógeno e seu comportamento quanto a tolerância aos cúpricos, foram objetivos deste trabalho: (1) Caracterizar a diversidade genética, através de rep-PCR, de isolados de Xcv coletados no Vale do São Francisco, entre os anos de 2003 e 2006, comparando-os aos isolados já caracterizados, coletados entre 1998 e 2001; (2) Determinar níveis de tolerância ao cobre em isolados de Xcv representativos de diferentes épocas (1998 a 2006) e áreas de coleta; (3) Detectar e caracterizar em Xcv a presença de regiões homólogas ao gene copA que confere resistência ao cobre em Xanthomonas spp. Os “fingerprints” gerados por rep-PCR, a partir do DNA purificado de Xcv coletados em diferentes anos, áreas e variedades de Vitis vinifera L. foram eficientes e reprodutíveis, constituindo-se em uma importante ferramenta no estudo da genética populacional deste patógeno. Os resultados indicaram ter ocorrido uma possível estabilização da população heterogênea observada por Trindade et al. (2005), além de permitir a observação de bandas comuns e perfis homogêneos entre os isolados que podem ser utilizados para o diagnóstico. Entretanto, não foi possível correlacionar, através dos estudos das seqüências repetitivas, a origem geográfica, a época de coleta ou a cultivar de origem dos isolados com os perfis genômicos. Nos testes de tolerância in vitro aos íons de cobre, de uma forma geral observou-se uma evolução no crescimento da tolerância ao cobre ao longo dos anos, em que isolados de Xcv foram coletados nas áreas de ocorrência do cancro bacteriano de 1998 a 2006. Os resultados do presente estudo confirmam aqueles já relatados anteriormente, de que as estirpes brasileiras apresentaram variabilidade na tolerância ao cobre e que esta tolerância ocorre naturalmente nas regiões produtoras. Araújo (2001) mostrou que essas estirpes mais tolerantes ocorrem na região de Petrolina, e no presente trabalho, demonstrou-se que também ocorrem em outras áreas como Bahia e Piauí. Amplificações com os “primers” desenhados a partir de seqüências do gene copA de X. axonopodis pv. citri e X. campestris. pv. campestris foram observadas para todos os isolados de Xcv testados. A alta homologia entre os produtos das amplificações com os “primers” copAR e copAL a partir do DNA dos isolados de Xcv com o gene cop A, confirmou a existência do gene em Xcv. A árvore filogenética gerada com alta reprodutibilidade mostrou maior distância de Xcv em relação a X. oryzae pv. oryzae e X. campestris pv. campestris e maior proximidade com X. axonopodis pv. citri. Este fato pode ser um indicativo de maior afinidade de X. campestris pv. viticola com a espécie X. axonopodis do que com X. campestris, confirmando as observações de Takita et al. (2004) em trabalho analisando a região rpf. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The production of table grapes (Vitis vinifera L.) in Brazil has increased mainly in the irrigated areas of the “Submédio” of the São Francisco valley, northeastern Brazil. This region is responsible for 15 % of the grape production of the country, corresponding to nearly 98 % of the annual exports. Among the many phytosanitary problems that affect grape production, bacterial canker is the most important bacterial disease affecting several V. vinifera cultivars in that region. The disease is caused by Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv). Although it was reported in 1998, it is believed that it has been present in the region since 1996, without being detected. It is important to monitor the population variability through time, which can be achieved by using molecular markers. Another relevant fact is the continuous, excessive and frequently inadequate use of copper-based fungicides that can lead to resistance in bacteria. Considering the importance of bacterial canker for grape production in Brazil and the lack of information on pathogen variability and its behavior regarding copper tolerance, the objectives of this work were: (1) to characterize the genetic diversity, using rep-PCR, among Xcv strains collected from 2003 to 2006, comparing them to a population already characterized, collected between 1998 and 2001; (2) to determine tolerance levels to copper in Xcv strains, selected to represent different collection years (1998 to 2006) and collection sites; and (3) to detect and characterize in Xcv the presence of homologous regions to the copA gene, which is involved in copper resistance in Xanthomonas spp. The fingerprints generated by rep-PCR using bacterial purified DNA from isolates collected in different years, areas and from different grape cultivars were reproducible and the results indicated lower levels of polymorphism among the isolates collected from 2003- 2006 than among the isolates previously characterized by Trindade et al. (2005). The profiles were generally very homogeneous and several common bands among isolates were detected. However, it was not possible to correlate geographic origin, collection year or cultivar with the rep-PCR genomic patterns. In vitro tests were conducted to assess tolerance to copper ions in Xcv. The results showed a general increase in copper tolerance from 1998 through 2006 and also showed variation in the minimum inhibitory concentration among the isolates. Previous studies demonstrated that this tolerance occurs naturally in the Petrolina region (Pernambuco state). Here we observed variation in tolerance also in isolates from Bahia and Piauí states. PCR- amplifications with primers (copAR and copAL) selected from the copA sequences of X. axonopodis pv. citri and X. campestris pv. campestris were observed for all Xcv isolates. After sequencing of the 925-bp PCR product, high sequence homology between Xcv sequences and those from X. axonopodis citri and X. campestris pv. campestris was observed, thus confirming the presence of the copA gene in Xcv. The phylogenetic analysis showed a closer relationship between Xcv and X. axonopodis pv. citri than with X. oryzae pv. oryzae or X. campestris pv. campestris. This suggests a closer proximity with the species X. axonopodis than with X. campestris, confirming the observations of Takita et al. (2004) when analyzing the rpf gene region.