Desenvolvimento, caracterização e mapeamento de microssatélites de tetra e pentanucleotídeos em eucalyptus spp

Abstract

Marcadores microssatélites permitem o gerenciamento de variabilidade genética, proteção varietal e identificação individual em populações de melhoramento e produção de Eucalyptus. A análise de locos microssatélites em sistemas “multiplex” (i.e. vários locos analisados simultaneamente) vem sendo realizada tradicionalmente com microssatélites dinucleotídeos cujos alelos diferem em apenas dois pares de bases. Entretanto o padrão de qualidade recomendado internacionalmente para a investigação genética forense estabeleceu a utilização exclusiva de microssatélites baseados em repetições de tetra ou pentanucleotídeos. A maior diferença de tamanho entre os alelos e a minimização de artefatos de amplificação permitem uma interpretação significativamente mais robusta de genótipos em comparação a dinucleotídeos e conseqüentemente uma fácil e confiável comparação de perfis genotípicos entre laboratórios. O objetivo deste trabalho foi, portanto, o desenvolvimento, caracterização e mapeamento genético de uma nova categoria de microssatélites para espécies de Eucalyptus, baseados em repetições de tetra e pentanucleotídeos. Um banco de dados de 18.510 mil seqüências genômicas derivadas de clones de cromossomos artificiais de bactérias (BAC) de E. grandis totalizando 9,6 mega pares de bases foram mineradas para repetições de tetra e pentanucleotídeos e pares de iniciadores desenhados automaticamente para flanquear repetições totalizando dez ou mais pb. Dos 304 e 196 pares de iniciadores desenhados para a amplificação de locos tetra e pentanucleotídeos perfeitos, respectivamente, foram selecionados 80 locos de tetra e 30 de pentanucleotídeos para estudos detalhados. Após uma triagem em eletroforese de alta resolução foram selecionados 22 locos tetra e 10 pentanucleotídeos os quais foram geneticamente mapeados e caracterizados para número de alelos, heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho), probabilidade de identidade (PI), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e conteúdo de informação polimórfica (PIC) em amostras populacionais de seis procedências das três principais espécies plantadas de Eucalyptus no mundo (E. grandis, E. globulus e E. urophylla). Os locos tetra e pentanucleotídeos selecionados revelaram um conteúdo informativo inferior àquele de dinucleotídeos, embora adequado para discriminar indivíduos e determinar parentesco com elevada precisão. Ao avaliar a capacidade efetiva de discriminação individual em um grupo de 46 clones elite plantados comercialmente 5 locos tetra ou pentanucleotídeos foram suficientes para identificar unicamente todos os clones. A herança mendeliana de todos os 32 locos selecionados foi confirmada. Destes, 23 locos apresentaram uma configuração de segregação que permitiu o seu mapeamento genético em 8 dos 11 grupos de ligação com base em mapas de referência de duas famílias de E. grandis x E. urophylla. Dois sistemas multiplex, cada um com 7 locos selecionados foram testados com sucesso disponibilizando assim os primeiros sistemas de análise genética de alta precisão para espécies de Eucalyptus, passíveis de adoção em escala internacional para a análise genética de clones e populações. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Microsatellite markers allow the management of genetic variation, varietal protection and individual identification in breeding and production populations of Eucalyptus. The analysis of microsatellite markers in multiplexed systems has been traditionally accomplished using dinucleotide repeat based loci whose alleles differ by only two base pairs. However the golden standard recommended for individual identification in forensic genetics requires the exclusive use of microsatellites based on equal or higher than tetranucleotide repeats. The larger difference in allele size and the reduction in amplification stuttering artifacts allows a significantly more robust genotype calling and thus an easier and more reliable comparison of multilocus genotypes across laboratories. The objective of this work was, therefore, the development, characterization and mapping of a novel category of microsatellites for Eucalyptus species, based on tetra and pentanucleotide repeats. A database of 18,510 sequences derived from Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) clones of E. grandis totalling 9.6 mega basepairs of high quality sequence was mined for tetra and pentanucleotide repeats and primers designed automatically to flank repeats equal or larger than 10 bp. Out of the 304 and 196 primer pairs designed for perfect tetra and pentanucleotide repeats respectively, 80 tetranucleotide and 30 pentanucleotide based loci were selected for detailed studies Following a screening step for polymorphism in high resolution PAGE, 22 tetra and 10 pentanucleotide repeat based loci were selected and genetically mapped and characterized for numbers of alleles, observed and expected heterozigosity, probability of identity (PI), probability of paternity exclusion (PE) and polymorphism information content in population samples of six provenances of the three most widely planted species of the genus (E. grandis, E. globulus e E. urophylla). The tetra and pentanucleotide repeat loci showed a lower information content when compared to dinucleotide repeat markers however fully adequate to discriminate individuals and determine parentage with confidence. When assessing the actual discrimination power on a gruoup of 46 commercially planted Eucalyptus clones, five tetra or pentanucleotide markers were sufficient to uniquely identify all the clones. The mendelian inheritance of all 32 selected loci was confirmed. Twenty three displayed a segregation configuration that allowed genetically mapping them on 8 of the 11 linkage groups using two reference maps of E. grandis x E. urophylla. Two multiplex systems, with 7 loci each were successfully tested introducing the first high precision systems of genetic analysis for species of Eucalyptus, likely to be internationally adopted for the genetic analysis of clones and populations.