Uso de baculovírus como ferrramenta para produção de antígenos vacinais e “virus like particles” (VLPs)

Abstract

Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados no controle biológico de pragas agrícolas e também como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas. Os baixos custos, a segurança na manipulação e as diferentes formas de expressão de proteínas tornam os baculovírus e células de inseto uma escolha eficaz para a correta expressão de antígenos vacinais e produção de VLPs (“Virus like particles”). No capítulo 1 deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo o EDIII (Domínio III da proteína de envelope do vírus da Febre amarela – FA) fusionado à proteína GP64 dos baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV); e também de uma massa protéica gerada pela fusão de EDIII com a proteína poliedrina de AcMNPV. O EDIII interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão das proteínas recombinantes (GP64 + EDIII e Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e confocal. No caso do EDIII fusionado à GP64 de AcMNPV e AgMNPV, as partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. O teste de proliferação de linfócitos indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparado com o controle LPS. Testes complementares serão feitos, para avaliar o perfil da resposta imunológica e confirmar a obtenção de um antígeno vacinal contra FA. No capítulo 2, o sistema baculovírus de expressão foi utilizado para expressar o precursor da proteína GAG (Pr55) de HIV-1. A expressão de Pr55 HIV-1 é suficiente para a montagem de VLPs na membrana plasmática da célula do hospedeiro. Porém, a proteína GP64 de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células infectadas e normalmente está presente na superfície da VLP. Neste trabalho, mostramos que não é possível separar BVs e VLPs produzidos em um mesmo ciclo de infecção por baculovírus mesmo usando diferentes metodologias de separação. Então, utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes livres de GP64, foi construído o vírus recombinante vGAGHIV-1 GP64 null e utilizado na infecção de células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no extrato de células infectadas com esse vírus recombinante. Essas mesmas células foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (o que resulta na ausência de produção de BVs), o brotamento de VLPs continua a acontecer. Essa técnica mostrou-se eficiente para a produção de VLPs livres de partículas ou proteínas baculovirais. Este trabalho confirma a eficiência do uso do sistema de expressão baseado em baculovírus para a expressão de proteínas e VLPs de interesse famacológico.