Estudos da proteína similar à esfingomielinase-D encontrada na biblioteca de cDNA da glândula da seda de Nephilengys cruentata

Abstract

A possibilidade de expressão de proteínas constituintes das sedas de aranhas em larga escala com a cinética desejada usando sistemas heterólogos, pode permitir sua aplicação em vários produtos médicos como curativos e microfilamentos de suturas para neurocirurgias. Neste contexto, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula da seda da aranha Nephilengys cruentata, onde foram encontrados, além dos genes estruturais da seda, outros ainda não descritos. Dentre estes, a predição da estrutura primária da seqüência codificante do clone H09, denominada proteína H09, apresentou identidade com uma esfingomielinase-D, principal responsável pelo loxoscelismo, condição clinica produzida por venenos provenientes de aranhas do gênero Loxosceles sp. O objetivo deste trabalho foi o estudo comparativo, filogenético e da expressão da seqüência codificante referente ao clone H09. A transcrição do mRNA correspondente ao clone H09 foi confirmada por meio de Northern Blot e RT-PCR havendo hibridização e amplificação somente para transcritos da glândula da seda de Nephilengys cruentata. De acordo com a análise filogenética, a proteína H09 apresentou um nível de similaridade de 29 a 35% com dez esfingomielinases descritas em Loxosceles sp. Utilizando análise tridimencional comparativa com o mesmo grupo de esfingomielinases e algumas defensinas do banco de dados Swiss-Prot, foi feita a predição da função da proteína H09, que se posicionou entre ambos os grupos indicando uma possível função de defesa. Para obtenção de grande quantidade de proteína H09, a seqüência codificante foi clonada no vetor de expressão pET21a e utilizadas três cepas de E. coli, Origami, PLYSs, que é própria para expressão de gene tóxicos e PRIL que possui copias adicionais de codons raros em E. coli. Estas linhagens foram transformadas na tentativa de expressar a proteína recombinante. Diversos parâmetros como tempo de indução, concentração de IPTG, temperatura de incubação, rotação e meio de cultura foram também testados na otimização do protocolo de expressão. Em nenhuma das condições avaliadas foi detectada a produção de H09 por meio de Western Blot. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The possibility to produce spider silk proteins in large scale and desirable function utilizing heterologous expression systems, will allow its application in different areas of medicine such as microfilaments for neurosurgeries. On these perspectives, a cDNA library from silk glands of Nephylengys cruentata was generated and have allowed the identification of silk-protein-encoding the structural sequences and novel genes still not described. The prediction of the primary structure codifying the clone H09, denominated protein H09, have presented identity with a sphingomyelinase-D, responsible for the disease called Loxocelism, a clinical condition produced by the venom derived from spider of the genus Loxoceles sp. The aim of this work was the comparative phylogenetic study and expression of the codifying sequence of the clone H09. To confirm the transcription of the mRNA related to the H09 clone, a northern blot and a RT-PCR were conducted comparing the silk glands transcripts from the N. cruentata venom. The results have shown that there was hybridization and amplification only in the first one. The phylogenetic analysis of the protein H09 have shown high similarity related with ten sphingomyelinase previously described. The function prediction of the clone H09 was conducted through a tri-dimensional comparative analysis with the same sphingomyelinase group and a few defensins. The results have shown an intermediate position of the clone H09 related to the other proteins. To obtain a large quantity of the protein H09, the codifying sequence was cloned in the vector pET21 and the three strains of E. coli were transformed in order to express the recombinant protein. Several parameters were evaluated such as induction, concentration of IPTG, temperature, shaker speed and culture medium in order to optimize the expression protocol. Among the utilized strains, PLISs is appropriated to express toxic proteins and PRIL carries additional copies of rare codon in E. coli. Among all the evaluated conditions there was no detection of the H09 protein utilizing “Western blot”.