Descrição do resistoma de solo de Cerrado stricto sensu e o potencial de dioxigenases metagenômicas na resistência antimicrobiana e em processos de biorremediação

Abstract

A resistência antimicrobiana tem sido uma grande ameaça à saúde humana, dada a disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs) em patógenos e micro-organismos clinicamente importantes, promovendo o aparecimento de cepas multirresistentes de difícil tratamento, complicado também pela queda na quantidade de novos antibióticos lançados no mercado. Assim, pesquisas por determinantes genéticos da resistência a antibióticos em isolados clínicos têm sido intensificadas desde os primeiros relatos de resistência antimicrobiana no começo do século XX. Neste contexto, a diversidade ambiental dos ARGs vem sendo subestimada, apesar do conhecimento de que a origem destes genes são os ambientes naturais, em particular o solo. Os micro-organismos presentes nesses ambientes são, em sua maioria, ainda não cultiváveis e consequentemente desconhecidos, o que os torna importantes fontes de novos genes e biomoléculas de interesse biotecnológico. Entretanto, analisar sua totalidade depende de técnicas independentes de cultivo. A metagenômica apresenta-se como uma ferramenta importante, já que acessa os micro-organismos de uma dada amostra ambiental pela extração do seu DNA total, permitindo identificar genes de interesse por abordagem de sequência ou funcional. Na pesquisa por novos ARGs, a metagenômica funcional é de grande valia para identificar novos mecanismos de resistência antimicrobiana e inferir a real diversidade de ARGs no meio ambiente, além de investigar os papéis ecológicos destes genes fora do ambiente clínico. Em trabalho anterior, observou-se a presença de três genes para putativas dioxigenases em dois clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de pequenos insertos (com insertos de 3-8 Kb) construída com DNA de amostras de solo de Cerrado. Nesta Tese, apresentam-se dois capítulos: o primeiro aborda a hipótese de que as dioxigenases putativas estão associadas ao fenótipo resistente observado. Dessa forma, três subclones foram construídos e denominados AMX3(2), AMX3(3) e CRB2(1), para posteriores análises fenotípicas e estruturais, onde CRB2(1) mostrou-se capaz de causar resistência à carbenicilina em Escherichia coli – adicionalmente, também mostrou-se capaz de resistir à ação do fenol. Em análises estruturais e enzimáticas, inferiu-se que o inserto é uma extradioldioxigenase com domínio bicupina, sendo uma provável gentisato 1,2-dioxigenase (GDO). Estas enzimas são importantes no metabolismo de compostos aromáticos, o que as torna potenciais em processos de biorremediação. No segundo capítulo está descrita a análise das sequências de seis clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de grandes insertos (com insertos de mediana de 35 Kb), também construída com amostras de DNA de micro-organismos de solo de Cerrado. A anotação gênica somou um conjunto de dados de aproximadamente 0,27 Mb, num total de 172 prováveis genes. Tais ORFs foram agrupadas em oito diferentes classes, de acordo com funções selecionadas. Dentre elas, 1,2% eram referentes a enzimas previamente relacionadas à resistência antimicrobiana e 5,8% a transportadores, que também são importantes protagonistas na resistência a xenobióticos. Apesar da grande diversidade de funções observadas, a maior parte das ORFs foi anotada como hipotéticas, sendo fontes para descrição de possíveis novos ARGs, assim como de genes de interesse biotecnológico. Essas observações indicam que a diversidade de ARGs em ambientes naturais difere daquela classicamente encontrada em isolados clínicos, o que evidencia a importância em acessar micro-organismos ambientais na tentativa de revelar novos mecanismos de resistência a antibióticos, que vem a enriquecer o conhecimento sobre seus papéis ecológicos e auxiliar pesquisas das indústrias biotecnológicas, como na prospecção de antimicrobianos e em processos de biorremediação.