Expressão de fragmentos de anticorpos que reconhecem o antígeno CD20 humano

Abstract

Em 1997, foi aprovado especificamente para o tratamento de pacientes com LNH de baixo grau (folicular) ou linfomas foliculares agressivos non-Hodgkin, o anticorpo recombinante anti-CD20: Rituximabe (MabThera®, Rituxan). Esse anticorpo, causa uma depleção seletiva e transitória de ambas subpopulações de células B CD20 positivas, normais ou malignas, dentro de etapas chaves da ontogenia das células B. Neste trabalho, objetivou-se a expressão, produção e purificação de fragmentos de anticorpos na forma FvFc específicos para o antígeno humano CD20, por meio de células de ovário de hamster chinês versão K1 (CHO-K1). Foram selecionadas duas versões scFvs humanizadas, contendo as CDRs do anticorpo monoclonal quimérico Rituximabe e uma versão scFv murina similar ao anticorpo original. Posteriormente, essas versões foram transferidas para o vetor de expressão em células de mamíferos pCOMIRES∆600. Esse vetor possui os genes que codificam os domínios CH2 e CH3 do fragmento cristalizável de imunoglobulina humana IgG, de forma que a proteína liberada pela célula de mamífero corresponda ao fragmento FvFc do anticorpo. Após a finalização das etapas de clonagens, as células CHO-K1 foram utilizadas como sistema de expressão e produção de anticorpos. Essas células foram mantidas na presença do antibiótico geneticina para a seleção da população mista de células CHO-K1 produtoras dos FvFcs recombinantes. Os sobrenadantes de cultura foram avaliados quanto á presença de FvFc por meio de imunodetecção ELISA. Posteriormente, foram submetidos a uma cromatografia de afinidade, utilizando a coluna HITRAP protein A HP. Após a purificação as frações coletadas da coluna, foram analisadas quanto ao grau de pureza destes fragmentos por meio do gel SDS-PAGE e Wersten-Blot. Com esses resultados foi possível realizar análises da capacidade de ligação das proteínas recombinantes por meio de citometria de fluxo. Os resultados também sugerem que é possível propor avaliações das proteínas recombinantes quanto à estabilidade conformacional, e em relação as funções efetoras realizadas pelo rituximabe.