Cultivo e filogenia molecular de Archaea a partir de amostras de aquário de água doce

Abstract

Membros do domínio Archaea encontram-se amplamente distribuídos na natureza, sendo frequentemente detectados em sedimentos, solos e ambientes aquáticos. Por outro lado, estudos recentes evidenciam a necessidade do cultivo laboratorial desses organismos, especialmente daqueles de ambientes não extremos, já que muitos aspectos de sua biologia permanecem ainda desconhecidos. Por esta razão, neste trabalho aprimoramos metodologias visando a obtenção de culturas de archaeas a partir de amostras de aquário de água doce residencial, utilizando a água deste aquário para a confecção dos meios de cultura. Visando favorecer o crescimento de archaeas oxidantes de amônia (AOAs), os meios de cultura foram adicionados de cloreto de amônio e suplementados com diversos antibióticos e antifúngicos, a fim de torná-los altamente seletivos para archaeas. Onze tipos coloniais foram selecionados e caracterizados quanto à morfologia celular por diferentes técnicas de microscopia, revelando a presença de células cocóides diminutas, com diâmetro médio de 1 µM, algumas vezes apresentando projeções celulares provavelmente envolvidas na adesão. Para as análises de filogenia molecular, DNA destas colônias foram utilizados em ensaios de PCR específicos para os genes de rRNA 16S dos Domínios Archaea e Bacteria e também o gene amoA, específico de AOAs, seguidos de sequenciamento de DNA. Os resultados revelaram que todas as colônias correspondiam a co-cultivos de archaeas pertencentes ao Filo Thaumarchaeota e bactérias dos gêneros Pandorea ou Cupriavidus. Foi também verificado o potencial nitrificante de algumas amostras, uma vez que foram detectadas sequências do gene amoA em alguns dos tipos coloniais selecionados. Paralelamente, foi construída uma biblioteca de genes de rRNA16S de Archaea, a partir do DNA total extraído de uma amostra de água e elementos do aquário. As análises filogenéticas desta biblioteca sugerem que o aquário consiste em um ambiente pouco diverso em termos da comunidade de Archaea presente. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Members of Archaea are found on a vast range of environments, including soils, sediments, and aquatic habitats. Recent studies stress the need of cultivation of mesophilic Archaea, since several physiological and biochemical aspects of these organisms remain unknown due to cultivation-independent techniques intrinsic limitations. In this work, we refined methodologies in order to obtain archaeal cultures from a freshwater aquarium, using the water from the aquarium to prepare the culture media. In order to favor the growth of ammonia oxidizing archaea (AOAs), the media were supplemented with ammonium chloride, and a number of antibiotics and antifungals. Eleven colonies were selected and characterized microscopically, revealing the presence of small coccoid cells, with an average diameter of 1 µM, sometimes presenting cell appendages probably involved in cell adhesion. Molecular phylogeny analyses were performed by PCR experiments specifically directed to the 16S rRNA genes of Archaea and Bacteria, as well as to the amoA gene, found only on AOAs, followed by automated DNA sequencing. The results revealed that all colonies consisted of co-cultures of archaeal cells belonging to phylum Thaumarchaeote, with bacteria of the genera Pandoraea or Cupriavidus. Some colonies were also positive for the presence of amoA gene, suggesting a nitrification potential of these samples. A genomic 16S rRNA library was also constructed from a sample consisting of water and other elements of the aquarium. The phylogenetic analyses of this library suggest that probably, the aquarium corresponds to an environment with a small diversity, in terms of the archaeal community.