Desenvolvimento de protocolos analíticos em metabolômica de leveduras fermentadoras de xilose

Abstract

O aumento na demanda por fontes de energia alternativa e as preocupações com os impactos ambientais tem incentivado o desenvolvimento de tecnologias para a produção de combustíveis a partir de biomassa lignocelulósica, como o etanol de segunda geração (2G). No entanto um dos açúcares mais abundante nas biomassas lignocelulósicas, a xilose, não pode ser convertida a etanol devido à incapacidade da levedura Saccharomyces cerevisiae, microrganismo mundialmente utilizado na indústria para produção de etanol, de converter eficientemente esse substrato em xilulose. A tecnologia baseada em metabolômica mostra-se eficiente, como uma ferramenta para auxiliar na determinação das etapas limitantes na via metabólica de fermentação da xilose. Neste trabalho, foram desenvolvidos e otimizados dois protocolos para análise de metabolômica targeted, utilizando como plataforma analítica a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) com experimentos de MRM. Os métodos de separação foram baseados na cromatografia por pareamento iônico utilizando uma coluna de fase reversa (HSS-T3) e na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), utilizando uma coluna quimicamente modificada com o grupo amida. Catorze padrões de metabólitos presentes na via de fermentação da xilose puderam ser identificados através de dois métodos complementares. Estes protocolos foram aplicados qualitativamente durante a avaliação de duas leveduras, Scheffersomyces stipitis e Spathaspora passalidarum. O preparo de amostra foi realizado em duas etapas: quenching e extração dos metabólitos. Os métodos de separação e detecção se mostraram promissores para a análise de rotina em processos de fermentação de xilose.