Mecanismos moleculares das proteínas acessórias NEF e VPU relacionados à patogênese do HIV-1

Abstract

A modulação de CD4 é uma das principais características da infecção por HIV e Nef desempenha um papel importante neste processo. Foi observada uma clara relação entre a degradação do receptor viral CD4, com o aumento da infecciosidade e a replicação viral, sugerindo a participação deste fenômeno na patogênese e progressão da infecção. No entanto, os mecanismos envolvidos na internalização e degradação de CD4 mediada por Nef não são totalmente compreendidas e diferentes proteínas celulares têm sido apontadas como importantes parceiros celulares de Nef. Nef agiria na superfície celular como um conector da cauda citoplasmática da molécula CD4, com membros do complexo adaptador heterotetramérico de clatrina, redirecionando a molécula CD4 para vesículas endocíticas. Uma bomba de prótons vacuolar (V-ATPase) e a proteína Epsn15 foram envolvidas no aumento da força de ligação Nef e a subunidade μ2 de AP-2. Com a finalidade de evitar a reciclagem de CD4 para a superfície celular, uma segunda conexão entre CD4 e a proteína β-COP é estabelecida por Nef, o que permitiria direcionar o receptor para degradação lisossômica. Adicionalmente, duas proteínas foram também envolvidas no mecanismo a tioesterase humana II (hTE-II/AcoT8) e a dinamina 2 (Dyn2). Entretanto experimentos para validar a relevância fisiológica dessas proteínas não foram conclusivos. Neste trabalho, pretendemos determinar a relevância fisiológica das proteínas: AP1, AP2, AP3, VH1 ATPase vacuolar, β-COP e AcoT8, na modulação de CD4 mediada por Nef, em linhas de células T e linfócitos T CD4+ de sangue periférico, infectados pelo HIV-1 . Primeiramente, análises de FRET-FACS entre alelos de Nef e as proteínas celulares apresentaram diferentes níveis de interação. O receptor CD4 mostrou variáveis níveis de interação com os alelos de Nef, NA7, NL4.3 e Mac239 (39%, 15% e 13%, respectivamente) e uma forte interação com as proteínas Ap2, β-COP (50,4%, 32% respectivamente). Por outro lado os alelos de Nef mostraram interagir principalmente com Ap2, β-COP e AcoT8, este ultimo apenas com o alelo NA7. Experimentos de microscopia confocal confirmaram os resultados obtidos por FACS-FRET mostrando em alguns casos alterações claras na localização subcelular destas proteínas. Finalmente, o silenciamento da expressão endógena das proteínas celulares na linha de célula T SupT-1 e em linfócitos primários CD4+ mostrou a proteína AP2 como sendo necessária e suficiente para a modulação de CD4 mediada por Nef.