Sequenciamento, análise, clonagem e expressão de genes de celulases e hemicelulases oriundos de bibliotecas metagenômicas de solo e rúmen

Abstract

A celulose é o polissacarídeo mais abundante da Terra e pode ser encontrada na parede celular das plantas. Para hidrolisar a celulose em resíduos de glicose é necessário um complexo de enzimas hidrolíticas envolvendo as enzimas endoglucanases, celobiohidrolases ou exoglucanases e as β- glicosidases. O uso industrial dessas celulases é bem diverso, abrangendo desde o processamento de algodão, a fabricação de papel, produção de detergentes, extração de polpa de frutas para a fabricação de sucos, o enriquecimento de ração para animais e na produção de bioetanol a partir da biomassa. Devido a essa grande variedade de usos para celulases é que a contínua busca por enzimas que sejam cada vez mais vantajosas na relação custo-benefício e eficiência se faz tão necessária. Uma técnica que pode ser usada na busca por essas novas enzimas é a metagenômica que permite o acesso ao material genético de micro-organismos não cultiváveis. Para a produção industrial dessas proteínas recombinantes, vários sistemas biológicos são empregados, principalmente a bactéria Escherichia coli e a levedura Pichia pastoris. Nesse trabalho foi feita a triagem de clones provenientes de uma biblioteca metagenômica de rúmen de caprino com fenótipo de degradação de celulases em 4 diferentes substratos: CMC LV, CMC HL, avicel e bagaço de cana pré-tratado. Desses clones 4 foram completamente sequenciados e analises de suas prováveis ORFs e proteínas, foi feita em comparação com bancos de dados existentes. Foi realizada a clonagem do gene endo 03, proveniente da biblioteca metagenômica de solo da Amazônia, no vetor de clonagem pJET e posterior clonagem no vetor de expressão pPICαA, para P. pastoris, e expressão em placa. A clonagem dos genes cbh I e cbh II provenientes da biblioteca metagenômica de rúmen de caprino, no vetor de clonagem pJET e posterior clonagem no vetor de expressão pET21a, para E. coli, e expressão das proteínas CBH I e CBH II. Também foi realizada a purificação parcial da proteína CBH II que permitiu a caracterização da temperatura ótima como 50ºC e do pH ótimo na faixa entre 5,0 e 6,0 para a proteína parcialmente purificada. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cellulose is the most abundant polysaccharide on the Earth and it can be found at cell wall of plants. To hydrolyze cellulose into glucose, a hydrolytic enzyme complex is needed. This enzymatic complex includes endoglucanases, celobiohydrolases or exoglucanases and β-glycosidases. The industrial use of cellulases is quite diverse, including cotton processing, paper manufacture, detergent production, extraction of fruits pulp for juice production, enrichment of animal feed and cellulosic ethanol production. Because of its large variety of uses cellulases continued search for even better enzymes with favorable cost-benefit is necessary. Metagenomics is a technique that allows access to genetic material of microorganisms not cultured yet. Different biological systems are used in industrial applications, especially the bacterium Escherichia coli and the yeast Pichia pastoris. On this work made a screening of 10 clones provinents of a goat rumen metagenomic librarie, with a cellulose degradation phenotype on 4 different substrates: CMC LV, CMC HL, avicel and pre-treated sugar-cane bagasse, of these clones, 4 were completely sequenced and analysis of probable ORFs and proteins comparing with the existing databanks. The cloning of gene endo 03, provinent of Amazon soil metagenomic librarie, in the cloning vector pJET and posterior cloning at expression vector pPICαA, to P. pastoris, and expression at plate. The cloning of genes cbh I e cbh II, provinent of goat rumen metagenomic librarie, at the cloning vector pJET and posterior cloning at expression vector pET21a, to E. coli, and expression of CBH I and CBH II proteins. The partial purification of CBH II protein and characterization of ideal temperature of 50ºC with an ideal pH between 5,0 and 6,0 to the protein partly purified.