Transcritoma e proteoma do fungo Paracoccidioides em condições de privação de glicose ou hipóxia

Abstract

Paracoccidioides spp. causa a paracoccidioidomicose, uma das micoses mais frequentes na América Latina. O fungo cresce como micélio no meio ambiente, e como levedura, no hospedeiro. A fim de sobreviver no corpo humano, patógenos devem se adaptar nos microambientes os quais são frequentemente caracterizados por baixas disponibilidades de nutrientes e oxigênio. Uma das primeiras linhas de defesa deste fungo durante invasão no hospedeiro são os macrófagos residentes nos pulmões, considerados pobres em aminoácidos e nutrientes. Durante a doença sistêmica, o fungo também pode atingir órgãos e tecidos onde o patógeno é exposto a variações nas concentrações de oxigênio. Neste estudo, as respostas de Paracoccidioides, Pb01, sob condições de privação de glicose e de oxigênio foram obtidas a partir de abordagens transcricionais (RNAseq), proteômicas (NanoUPLC-MSE e 2D-PAGE) e ensaio de complementação gênica. Os resultados revelaram que Pb01 muda seu metabolismo em resposta à privação de glicose. O fluxo de carbono é centrado na produção de etanol e gliconeogênese pela modulação de outras vias tais como β-oxidação e ciclos do glioxilato e ácido tricarboxílico. Mais ainda, as células privadas de glicose foram mais susceptíveis à morte por macrófagos indicando que a glicose proporciona vantagem na sobrevivência do fungo dentro dos macrófagos. Em relação à hipóxia, as respostas do Pb01 possivelmente são mediadas pelo fator de transcrição SrbA, uma proteína da família de ligação ao elemento regulatório esterol (SREBP). A PbsrbA é funcional no mutante nulo para o gene srbA, de A. fumigatus (ΔsrbA), e também restaura ambos, a susceptibilidade do ΔsrbA à classe de azóis de drogas antifúngicas e a produção de biomassa em resposta à condições de privação de ferro. Além disso, os níveis de transcritos e proteínas de células leveduriformes do Pb01 mostraram que, em hipóxia, o fungo aumenta a expressão de transcritos associados com a glicólise e biossínteses de ergosterol e ácidos graxos. Um aumento na abundância de proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos, carboidratos, lipídios/ ácidos graxos, produção de etanol e destino protéico foi detectado por análises em gel bi-dimensional além da redução daquelas relacionadas a processos oxidativos (de aminoácidos, ácidos graxos e acetaldeído), TCA e transporte de elétrons. Desde que estudos têm mostrado a importância do metabolismo de carbono e adaptação à hipóxia nos fungos, concluímos que a caracterização das respostas de Pb01 às condições de privação de glicose e de oxigênio é importante para elucidação de importantes moléculas e processos relevantes para o entendimento do estabelecimento fúngico no hospedeiro. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Paracoccidioides spp. represent the causative agent of paracoccidioidomycosis, one of the most frequent systemic mycoses in Latin America. The fungus grows as mycelium in the environmental, and as yeast form, in the host tissue. To survive in the human body, pathogens must adapt to microenvironments which are often characterized by low nutrient and oxygen availability. One of the first lines of defense during Paracoccidioides spp. host invasion are the lung resident macrophages, considered a glucose- and amino acid-poor environment. During the systemic disease, it also can reach organs and tissues where the pathogen is exposed to variations in oxygen concentrations. In this study, a comprehensive response of Paracoccidioides, isolate Pb01, under glucose and oxygen deprivation was accessed by transcriptional (RNAseq), proteomic (NanoUPLC-MSE and 2D-PAGE) and genetic complementation approaches. The results revealed that Pb01 changes its metabolism to responds to glucose deprivation. The carbon flow is focused in gluconeogenesis and ethanol production through β-oxidation, glyoxylate and tricarboxylic acid cycles modulations. Moreover, the glucose deprived cells are more susceptible to macrophages killing indicating that the glucose provides a survival advantage to Pb01 inside macrophages. Regarding hypoxia, the responses of Pb01 showed that it is possibly mediated by a highly conserved transcription factor, SrbA, a protein of the sterol regulatory element binding protein family. Our results showed that the PbsrbA is functional in a null mutant of srbA of A. fumigatus (ΔsrbA) and also restore both, the susceptibility of ΔsrbA to the azole class of antifungal drugs and the biomass production in response to low iron conditions. Furthermore, the transcripts and proteins levels of the Pb01 yeast cells under hypoxia showed that Pb01increases the expression of transcripts associated with glycolysis and ergosterol/ fatty acid biosynthesis. In addition, as detected by 2D-PAGE, the fungus also increases the abundance of proteins involved in amino acid, carbohydrate and lipid/fatty acids metabolism, ethanol production and protein fate and reduce of those related to oxidative processes (amino acids, fatty acid and acetaldehyde), TCA and electron transport. Because studies have highlighted the importance of carbon metabolism and hypoxia adaptation in fungi, we conclude that the characterization of glucose and oxygen deprivation responses in Pb01 is important to elucidate molecules and processes relevant in the understanding of the fungal establishment in the host.