Análise funcional do gene ERG6 em Cryptococcus neoformans

Abstract

O advento de pacientes portadores do HIV e de pacientes imunocomprometidos provocou um aumento na incidência de micoses fúngicas, como a criptococcose. Existem várias classes de antifúngicos disponíveis comercialmente para o tratamento dessas infecções que são utilizadas de acordo com a patologia e o patógeno. No entanto, são relatados casos de resistência a essas drogas e existe uma grande preocupação em relação aos efeitos adversos que elas podem causar nos pacientes. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas poderia ser uma solução para a problemática atual das drogas disponíveis e isso requer o estudo de novos alvos moleculares. O gene ERG6 codifica a enzima esterol C-24 metiltransferase que atua na conversão de zimosterol em fecosterol. Constitui uma etapa que ocorre em fungos para a biossíntese do ergosterol, mas não ocorre nos hospedeiros animais, que possuem enzimas específicas para a conversão do zimosterol até colesterol. No presente trabalho, a função do gene ERG6 foi investigada e caracterizada no fungo Cryptococcus neoformans demonstrando que a ausência desse gene gera diversas alterações fenotípicas, tais como sensibilidade ao estresse osmótico, ao estresse oxidativo e maior susceptibilidade a diferentes drogas antifúngicas. Além disso, foi ainda observado que a capacidade de crescer em meios contento diferentes estressores de parede se mostra alterada. Em relação aos fatores de virulência conhecidos para C. neoformans, o fungo foi incapaz de crescer a temperatura de 37°C, porém não teve sua produção de cápsula ou melanina afetadas. No entanto, em testes para observação da sua capacidade de virulência in vitro utilizando macrófagos e in vivo com lagartas da espécie Galleria mellonella mostraram uma redução na virulência em mutantes de ERG6. Por fim a análise dos esteróis de membrana mostrou que ocorre uma alteração em toda a composição de esteróis da membrana celular. Dessa forma, por ser uma enzima encontrada principalmente em fungos, a Erg6 pode ser um alvo molecular potencial para drogas antifúngicas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The advent of HIV patients and immunocompromised patients caused an increase in the incidence of fungal mycoses, such as cryptococcosis. There are several antifungal agents commercially available for the treatment of such infections that are chosen based on the disease and the pathogen. However, cases of resistance are reported to these drugs and there is great concern about the adverse effects that they can cause on patients. In this context, the development of new antifungal drugs could be a solution to the current problem of the available drugs and it requires the study of potential molecular targets. The gene ERG6 encodes the sterol C-24 methyltransferase, an enzyme that acts on the conversion zimosterol in fecosterol. This is a step that occurs in fungi in the ergosterol biosynthesis, but does not occur in the animal hosts which have specific enzymes for the conversion of zymosterol to cholesterol. In this study, gene function of ERG6 was investigated and characterized in the Cryptococcus neoformans demonstrating the absence of this gene generates several phenotypic changes, such as sensitivity to osmotic stress, oxidative stress and increased susceptibility to different antifungal drugs. Furthermore, it was also observed that the ability to grow on media with different cell wall stressors was also altered. It was observed that the lack of ERG6 greatly affects the permeabillity of the membrane resulting in osmotic and oxidative stress sensitivity and changing antifungal drugs susceptibility. Furthermore, it was also observed that the ability to grow in medium with cell wall stressor was altered. About the virulence factor, C. neoformans was unable to grow at 37°C, but it had not affected the production of melanin or capsule. However, virulence tests in vitro with macrophages and in vivo with Galleria mellonella caterpillars showed a decrease in the virulence of ERG6 mutants. Finally, the membrane sterols analysis demonstrated a change in the membrane sterol composition. Thus, being an enzyme found especially fungi, the Erg6 may be a potential molecular target for antifungal drugs.