Interferência de RNA para silenciamento gênico da enzima NO sintase neuronal (nNOS) no modelo in vitro de neurodegeneração por interferon gama

Abstract

A vulnerabilidade de neurônios dopaminérgicos a insultos químicos continua sendo uma questão relevante na neuropatologia. Estudos anteriores revelam aumento dos níveis de interferon gama (IFN- ) e da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) durante a injúria de células neuronais. Entretanto, até o momento, nenhum trabalho avaliou se a nNOS afeta a viabilidade de neurônios dopaminérgicos expostos ao IFN- . Para avaliar o papel da nNOS nas respostas celulares ao IFN- , o presente estudo realizou silenciamento gênico da enzima nNOS via interferência de RNA (RNAi) no modelo de neurodegeneração de células SH-SY5Y. Primeiro, analisou-se o conteúdo de RNAm de nNOS através de PCR em tempo real. Três RNAs interferentes sintéticos curtos foram testados nos tempos de 8h e 24h, em doses de 18,75nM e 37,5nM. Testou-se também um vetor de expressão de grampos curtos de RNA, denominado pnNOS_hum_4400 para o silenciamento da enzima. Os efeitos do silenciamento de nNOS sobre a viabilidade das células SH-SY5Y lesadas foram medidas via ensaio de 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). O melhor efeito de silenciamento de nNOS ocorreu no tempo de 24h pós-transfecção para siRNAnNOShum_3987 e siRNAnNOShum_4400, com diminuição de 0,46 e 0,66 vezes. SiRNAnNOShum_4400 e o vetor pnNOS_hum_4400 aumentaram a viabilidade das células lesadas por IFN-y em 5,0 % e 15,8%, respectivamente. Conclui-se que a enzima nNOS participa de eventos celulares ligados à injúria de células SH-SY5Y causada pelo IFN- y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The vulnerability of dopaminergic neurons to chemical insults remains a relevant issue in neuropathology. Previous studies found increased levels of interferon gamma (IFN- ) and the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) during neuronal injury. No previous work, however, has evaluated whether nNOS affects the viability of dopaminergic neurons exposed to IFN- . To gain more insight into the role of nNOS in cell responses to IFN- , the present study carried out the enzyme gene silencing by RNA interference (RNAi) in the neuron-like SH-SY5Y model of neurodegeneration. We first analyzed the nNOS mRNA knocking down by using a reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Three small interfering RNAs were tested at 8h and 24h in doses of 18.75nM and 37.5nM. We also tested a short-hairpin RNA expression vector named pnNOS_hum_4400 to improve enzyme knocking-down. nNOS silencing effects on the viability of injured SH-SY5Y cells were measured by the 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The highest knocking down in nNOS mRNA content occurred at 24h post-transfection for siRNAnNOShum_3987 and siRNAnNOShum_4400, with 0.46 and 0.66 fold decrease. SiRNAnNOShum_4400 and the vector pnNOS_hum_4400 ameliorate the viability of cells injured by IFN- 5,0 % 15,8 % ely. We concluded that nNOS enzyme plays at least a partial role in SH-SY5Y cell degeneration caused by IFN-y .