Produção, caracterização e purificação de complexos enzimáticos holocelulotícos produzidos por Clostridium thermocellum (isolado B8) na presença de substratos lignocelulósicos

Abstract

A busca por fontes de combustíveis renováveis tem ocupado o centro de discussões em função da necessidade da redução da poluição proveniente da queima de combustíveis fósseis e a uma adequação da matriz energética atual. No Brasil, a proposta é utilizar biomassa vegetal para a produção de bioetanol de segunda geração produzido a partir de resíduos agroindustriais (bagaço e palha de cana de açúcar e piolho de algodão), sendo que uma das etapas limitantes para esse fim é a hidrólise desta biomassa para produção de açúcares fermentáveis. A linhagem de Clostridium thermocellum (Isolado B8) isolada de rúmen de caprinos da raça Moxotó foi caracterizada como capaz de hidrolisar as biomassas citadas e de secretar enzimas e complexos enzimáticos (celulossomas) com atividade de carboximetilcelulase (CMCase) e xilanase. Estas atividades foram detectadas nos sobrenadantes das culturas e também nas frações de proteínas celulossomais, eluídas do substrato residual (FES) e recuperadas do sobrenadante por adsorção a celulose cristalina (FEC).. A fração de proteínas celulossomais eluídas dos substratos palha de cana de açúcar, bagaço de cana-de-açúcar e piolho de algodão, denominadas FES, apresentaram valores mais significativos de atividade de CMCase na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e de xilanase de 6,0, e valores de temperatura ótima na faixa entre 65°C e 70°C para CMCase e xilanase. A fração de proteínas celulossomais de palha de cana apresentaram uma média de 80% de retenção da sua atividade de xilanase e CMCase quando incubadas a 70°C por 6 horas. As amostras FEC e FES das fontes de carbono utilizadas apresentaram perfis semelhantes de bandas protéicas pela análise de atividade em gel, sendo observadas 6 bandas com atividade de CMCase e 7 bandas com atividade de xilanase. As amostras FES das diferentes fontes de carbono fracionadas em coluna de exclusão molecular apresentaram perfis cromatográficos diferentes com relação ao volume de eluição dos picos protéicos com massa molecular estimada acima de 2 MDa, e em análise por DLS (Espalhamento de luz dinâmica) foi estimado uma proteína com a massa estimada de 6,5MDa para a amostra de bagaço de cana e palha de cana. Duas proteínas presentes na fração de palha de cana foram identificadas por espectrometria de massa: a proteína estrutural (CipA) e a exoglucanase (CelS). Estes resultados indicam o potencial de utilização do isolado B8 como fonte de atividades enzimáticas holocelulolíticas com propriedades cinéticas adequadas para aplicação industrial.O isolado B8 secreta celulossoma quando cultivado em diferentes fontes de carbono e estes apresentam constituições distintas podendo contribuir para o desenvolvimento de processo industrial para hidrólise enzimática destes resíduos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The search for sources of renewable fuels has been at the center of discussions around the need of reducing pollution from the burning of fossil fuels and the adequacy of current energy matrix. In Brazil, the proposal is to use biomass for the production of second generation bioethanol produced from agricultural and industrial waste (sugar cane straw and bagasse,and cotton louse), and one of the limiting steps for this purpose is the hydrolysis of this biomass for production of fermentable sugars. The strain of Clostridium thermocellum (Isolated B8) isolated from the rumen of Moxotó goats was characterized as capable of hydrolyzing the biomass cited and secrete enzymes and enzyme complexes (Cellulosomes) with carboxymethylcellulase activity (CMCase) and xylanase. These activities were detected in the culture supernatants and also in cellulosomal protein fractions, eluted from the residual substrate (FES) and recovered from the supernatant by adsorption crystalline cellulose (FEC). The fraction eluted cellulosomal protein substrates of sugar cane straw, sugar cane bagasse and cotton louse, called FES, showed more significant CMCase activity at pH 5.0 to 7.0 and xylanase of 6.0 and optimum temperature values in the range between 65°C and 70°C for CMCase and xylanase. The protein fraction cellulosomal of straw showed a mean 80% retention of its CMCase and xylanase activities when incubated at 70°C for 6 hours. Samples FEC FES from the carbon sources used showed similar profiles of protein bands by activity gel analysis, were observed 6 bands with CMCase activity and 7 bands with xylanase activity. The samples FES of different carbon sources fractionated on a column of molecular exclusion showed different chromatographic profiles with respect to the elution volume of the protein peaks with estimated molecular weight above 2 MDa. Pooled fractions analyzed by DLS (dynamic light scattering) peaks were detected consisting of high molecular weight proteins, with the estimated mass of 6.5 MDa for the sample of bagasse and cane straw. Two proteins present in the fraction of straw were identified by mass spectrometry: the structural protein (CipA) and exoglucanase (CelS). These results indicate the potential use of isolated B8 as a source of xylanases and CMCases activities with kinetic properties suitable for industrial applying. The isolated B8 releases cellulosome when grown on different carbon sources and these have different constitutions and could contribute to the development of industrial processes for Enzymatic hydrolysis of these residues.