Caracterização molecular e biológica de um isolado de Tomato yellow vein streak virus

Abstract

A família Geminiviridae é caracterizada pela morfologia geminada das partículas e genoma composto por DNA circular de fita simples. Esta família é dividida em quatro gêneros, Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus e Topocuvirus, de acordo com a espécie de inseto vetor, círculo de hospedeiros e organização genômica. Os begomovírus, em sua maioria, possuem dois componentes genômicos (DNA-A e DNA-B), são transmitidos por Bemisia tabaci (mosca-branca) e infectam plantas dicotiledôneas. A disseminação de begomovírus em diversas partes do Brasil está associada à introdução e dispersão do biótipo B de B. tabaci, que atualmente tem destacada importância como vetor dos begomovírus, não apenas para o tomateiro, mas também para outras hortaliças e mais recentemente, a batata (primeiro relato feito há mais de 20 anos). Atualmente, esse grupo de vírus parece ser o mais importante afetando tomate (e batata, em surtos eventuais) no estado de São Paulo. O objetivo deste trabalho foi caracterizar molecular e biologicamente um begomovírus isolado de batata, denominado Ba-3, provavelmente pertencente à espécie Tomato yellow vein streak virus. Inicialmente, um novo método de clonagem foi desenvolvido utilizando a DNA polimerase do bacteriófago 29 via amplificação isotérmica em círculo rolante (RCA). Esta técnica se mostrou eficiente e simples para a realização de clonagens dos begomovírus. Para caracterização molecular, o genoma completo do Ba3 foi amplificado por RCA, clonado e a sequência genômica determinada. Para o seqüenciamento completo do DNA-A e DNA-B foram utilizados primers do vetor e primers internos em ambas as orientações. Análises comparativas indicaram que a identidade de seqüências do DNA-A do isolado Ba3 foi menor que 88% quando comparado com qualquer outro begomovírus com seqüência registrada até o momento, sugerindo que este isolado representa, provavelmente, uma nova espécie do gênero, nomeado como Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). Para o círculo de hospedeiros, clones contendo 1,5 cópias dos componentes virais foram produzidos e inoculados através de bombardeamento de partículas em plantas cultivadas e daninhas e a detecção realizada por PCR. A infecção foi comprovada em plantas de batata, tomate, Nicotiana benthamiana e Nicandra physaloides. Para o estudo preliminar de pseudo-recombinação, clones infecciosos dos vírus Tomato severe rugose virus (ToSRV), Sida micrantha mosaic virus (SimMV) e Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) foram utilizados. Foram observados sintomas em plantas de tomate inoculadas com DNA-A de ToYVSV-[Ba3] + DNA-B de ToSRV, DNA-A de ToSRV + DNA-B de ToYVSV-[Ba3] e DNA-A de ToRMV + DNA-B de ToYVSV-[Ba3] indicando que este isolado pode pseudo-recombinar com outros begomovírus. Estes resultados, juntamente com os estudos mais detalhados que permanecem em andamento, contribuirão para a validação do Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) como uma espécie definitiva no gênero Begomovirus. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Geminiviridae family is characterized by a geminated particle morphology and circular single-stranded DNA genome. This family is divided in four genera, Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus and Topocuvirus, based on insect vector species, host range and genome organization. The majority of begomoviruses has two genomic components (DNAA and DNA-B), and they are transmitted by Bemisia tabaci (whitefly) for dicotyledonous plants. In most regions of Brazil, the begomovirus dissemination has been associated to the introduction and spread of the B biotype of B. tabaci. They occur not only on tomatoes, but also on other vegetables and more recently, on potatoes (the first report was done more than 20 years ago). Currently, this virus seems to be the most important one infecting tomato (and potato in occasional epidemics) in the state of São Paulo. The objective of the present work was to characterize on its biological and molecular aspects the begomovirus isolated from potato, named Ba3, probably belonging to Tomato yellow vein streak virus species. Initially, a new cloning method was developed using the bacteriophage 29 DNA polymerase through rolling circle isothermal amplification (RCA). This technique was demonstrated to be efficient and simple for begomovirus genome cloning. For the molecular characterization, the complete genome of Ba3 was amplified, cloned and the genome sequence determined. The complete sequencing of DNA-A and DNA-B was done using vector and internal primers in both orientations. Analysis indicated that the Ba3 DNA-A sequence shared less than 88% nucleotide identity with any other begomovirus sequence avaliable, suggesting that this isolate most likely represents a new species of Begomovirus genus, named Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). For host range studies, clones containing 1.5 copies of each genome segment were inoculated via particle bombardment in cultivated and weed plants, and detection done by PCR. Infection was confirmed in potato, tomato, Nicotiana benthamiana and Nicandra physaloides plants. For a preliminary study of the ability to form pseudo-recombinants, infectious clones of the viruses Tomato severe rugose virus (ToSRV), Sida micrantha mosaic virus (SimMV) and Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) were used. Symptoms were observed in tomato plants inoculated with DNA-A of ToYVSV-[Ba3] + DNA-B of ToSRV, DNA-A of ToSRV + DNA-B of ToYVSV-[Ba3] and DNA-A of ToRMV + DNA-B of ToYVSV [Ba3] indicating that this isolate can form viable pseudo-recombinants with other begomoviruses. These results, together with more detailed studies which remain in course, will contribute to validate Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) as a definite species.