Estudo dos genes de virulência e avirulência envolvidos na interação tospovírus/planta hospedeira

Abstract

Espécies do gênero Tospovirus têm sido relatadas como agentes causais de doenças em diferentes culturas, no mundo, sendo transmitidos por diferentes espécies de tripes. O Tomato spotted wilt virus (TSWV) é a espécie-tipo do gênero Tospovirus e possui uma ampla gama de hospedeiros quando comparado com outros vírus do gênero. A partícula viral é envelopada e contém três segmentos de RNA designados S, M e L, que codificam duas proteínas não-estruturais (NSM e NSS) e três proteínas estruturais (L, N e o precursor das glicoproteínas GN e GC). A proteína NSM está envolvida no movimento do vírus célula-a-célula, enquanto que a NSS está envolvida na supressão de silenciamento gênico em plantas, demonstrado para o TSWV e para outro tospovírus, o Groundnut bud necrosis virus (GBNV) e também está relacionada com a expressão de sintomas nos tecidos foliares. Visando minimizar os danos causados por tospovírus, principalmente em cultivos de olerícolas, genes de resistência têm sido incorporados em variedades comerciais como o Tsw em pimentão e o Sw-5 em tomate. O entendimento dos processos de interação desses genes de resistência com genes virais constitui estratégia importante na durabilidade e estabilidade da resistência a esses patógenos. Este trabalho teve como objetivo geral estudar a interação entre tospovírus e plantas e foi dividido em três capítulos, sendo que no primeiro capítulo, foram determinadas as sequências completas de nucleotídeos do gene NSS de dois tospovírus relatados no Brasil, Groundnut ring spot virus (GRSV) e do Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV). As sequências foram comparadas com outras sequências NSS de tospovírus, disponíveis no banco de dados, permitindo a construção de árvores filogenéticas. Verificou-se que a NSs do GRSV e do ZLCV apresentou o mesmo tamanho, 1.404 nucleotídeos. A comparação das sequências de aminoácidos de GRSV com ZLCV mostrou uma identidade de 69,6%. Análises filogenéticas foram realizadas com base nas sequências NSS, depositadas no banco de dados, confirmando que as espécies estudadas pertencem ao grupo americano. O segundo capítulo foi dedicado ao estudo da interação entre TSWV e uma cultivar de pimenta resistente à infecção. No Brasil e no mundo, o estudo e o entendimento da morte celular programada (PCD) em células vegetais, induzida por infecções causada por fitopatógenos, ainda é incipiente. Resultados preliminares de ocorrência de PCD foram obtidos, utilizando o patossistema TSWV em Capsicum chinense PI 159236. Com o objetivo de estudar os domínios da proteína do nucleocapsídeo (N) de TSWV, responsável pela indução de reação de hipersensibilidade (RH) em genótipos de pimenta, foram construídas quimeras com troca de fragmentos genômicos do gene N de TSWV e Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (responsável por causar infecção sistêmica em alguns genótipos de pimenta), usando como ferramenta o vetor de expressão transiente pGreenII 62-K. Agroinfiltrações com as construções e um controle negativo, que consistiu da bactéria mais o meio de indução, foram realizadas em plantas de C. chinense. Sintomas de necrose foram observados nas folhas com 10 a 12 dias após a infiltração. O sintoma de necrose ocorreu devido à incompatibilidade da interação agrobactéria GV3101/C. chinense, sendo necessário, em uma próxima etapa do trabalho, utilizar outra cepa de Agrobacterium mais adequada a este tipo de avaliação e que não induza, precocemente, o sintoma de necrose foliar. O terceiro capítulo consistiu do aprofundamento dos estudos da interação entre TSW V e um gene de resistência derivado do tomateiro. Interações entre plantas e vírus são complexas e envolvem vários tipos de respostas que podem ou não causar doenças no hospedeiro. A RH é um mecanismo utilizado pelas plantas para impedir a disseminação do patógeno para as células vizinhas. Para identificar o gene do TSWV isolado BR-01, responsável por desencadear uma resposta do tipo RH em plantas de Nicotiana benthamiana transgênica (expressando o gene de resistência derivada do tomateiro: Sw-5b), os genes das proteínas N, NSM e NSS foram clonados, individualmente, no vetor binário pGR107 (pPVX - Potato virus X ) e no vetor de expressão transiente pEAQ-HT Gateway, que também recebeu os genes GN e GC e o precursor da glicoproteína. Plantas de N. benthamiana (Sw-5b) foram agroinfiltradas com as construções obtidas em pGR107 e pEAQ-HT GW. Lesões necróticas do tipo RH foram observadas apenas nas plantas inoculadas com a construção pGR107 + NSM, diferindo dos sintomas causados pelas construções pGR107 + N e pGR107 + NSS. Entretanto, em inoculações realizadas com o vetor pEAQ, não foram observados sintomas do tipo RH nas agroinfiltrações realizadas com a construção pEAQ-HT GW + NSM. Verificou-se que a proteína NSM apresentou-se fragmentada em duas bandas quando detectada por Western blot, podendo ser esta a causa do não aparecimento da resposta do tipo RH com a inoculação dessa construção. Outra hipótese seria a necessidade de translocação da proteína NSM para a indução da RH, fato que poderia ser propiciado pelo vetor PVX, porém não ocorreria com o vetor de expressão pEAQ-HT GW. Visando a elucidação dessas hipóteses os trabalhos serão continuados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The species type Tomato spotted wilt virus (TSW V) of the genus Tospovirus, has a broad host range if compared with other viruses of the genus. The viral particle is enveloped and contains three ssRNA segments denoted S, M and L, encoding two non-structural proteins (NSM e NSS) and three structural proteins (L, N, and the glycoprotein precursor of GN and GC). The NSM protein is involved in the cell-to-cell movement, whereas NSS acts as silencing suppressor in the affectedplants. This role was demonstrated for both TSWV and Groundnut bud necrosis virus (GBNV). The NSS is also related to the symptoms expression in plants. Strategies to minimizing the damages caused by tospoviruses, mainly in horticultural crops have been implemented based on resistance genes as Tsw in sweet-pepper and Sw-5 in tomato. Understanding the interactions between resistance and viral genes are essential to generate stable and durable resistance to these pathogens. This work had the general aim to study the interaction of tospoviruses and plants and it was divided into three chapters. In the first chapter, the complete nucleotide sequence of NSS gene of two tospoviruses Groundnut ring spot virus (GRSV) and Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) were determined. The NSs sequence of GRSV and ZLCV was both 1,404 nucleotides-long. Pairwise comparison showed that the NSs amino acid sequence of GRSV shared 69.6% identity with that of ZLCV. The sequences were compared with other NSS sequences of tospovírus available in the database. Phylogenetic analysis based on NSs sequences confirmed that these species cluster in the American clade. The second chapter was devoted to study the interaction between TSWV and a pepper cultivar resistant to the infection. The understanding of programmed cell death (PCD) in plants, induced by pathogens, is still incipient. Previous results about the PCD occurrence were obtained by using the pathosystem TSWV/ Capsicum chinense In order to study the nucleocapsid protein (N) domains of TSW V, responsible to cause a hypersensitive response (HR) in pepper genotypes, chimeras were constructed with genomic fragments of TSWV and Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (responsible for causing systemic infection in some sweet pepper genotypes) was cloned into the pGreenII 62-K, a transient expression vector. Agroinfiltration was carried out in C. chinense plants with the pGreenII constructs and the negative control (just the Agrobacterium in the medium). Necrotic symptoms were observed 10 to 12 days after infiltration. The necrosis occurred dueto the interaction incompatibility between Agrobacterium GV 3101 and C. chinense plants. It was concluded that a different Agrobacterium strain that does not induce necrotic symptoms in the leaf must be used to enable this study, in a next step of this work. In the third chapter the interaction between TSW V and the resistance gene Sw-5 from tomato was studied. Interactions between plant and viruses are complex and involve several types of responses that may or may not cause disease to the host. The HR is a mechanism used by plants to prevent the spread of the pathogen to the neighboring cells. In order to identify the TSW V isolate BR-01 gene, responsible for triggering the HR in the transgenic Nicotiana benthamiana plants (Sw-5b), the N, NSM and NSSgenes were cloned individually in frame into the vector pGR107 (pPVX Potato virus X) and into the transient expression vector pEAQ-HT Gateway. The GN, GC and Glycoprotein precursor were cloned to into the pEAQ-HT GW vector. The constructs were agroinfiltrated in the transgenic N. benthamiana (Sw-5). HR-like necrotic lesions were seen only in leaves inoculated with the construct pGR107 + NSM, which differed significantly with symptoms caused by pGR107 + N and pGR107 + NSS. HR-like symptoms were not observed with pEAQ-HT GW + NSM. It was observed that the NSMprotein was not intact since two bands were detected by Western blot, suggesting that this could be the cause of the absence of the HR symptom in the inoculated plants. Another explanation would be the necessity of the NSM protein to move cell-to-cell to induce HR. This movement could be provided by the PVX vector, however does not occur when the pEAQ-HT GW was used. To elucidate these possible hypotheses, these studies will still be continued.