Detecção e caracterização de complexos multi-enzimáticos em secretoma de fungos filamentosos

Abstract

As enzimas que degradam parede celular vegetal produzidas por micro-organismos possuem aplicações biotecnológicas importantes, incluindo a produção de bioetanol. Algumas batérias anaeróbicas são capazes de produzir complexos multi-enzimáticos chamados de celulosomos, enquanto os fungos filamentosos normalmente secretam enzimas hidrolíticas individuais que atuam sinergisticamente no processo de degradação de polissacarídeo. Neste trabalho, nós mostramos que os fungos filamentosos Trichoderma harzianum e Trichoderma reesei, secretam complexos multi-enzimáticos ativos quando cultivados em meio contendo o resíduo agrícula bagaço de cana-de-açucar e lactose (ou galactose), respectivamente. O secretoma de ambos os fungos foram analisadas primeiramente por 1D-BN (blue native)-PAGE. Bandas eletroforéticas correspondendo a possíveis complexos foram submetidas à separação eletroforética usando sistema Tricina-SDS-PAGE para demonstrar que são constituídas de componentes menores. Ensaios zimográficos foram realizados usando 1D-BN-PAGE e 2D-BN/BN-PAGE para verificar atividades celulolítica e xilanolítica em um mesmo complexo. Finalmente, os complexos foram digeridas por tripsina e analisadas separadamente por LC-MS/MS e os programas MASCOT e MS-BLAST para identificação das proteínas constituintes. Os resultados mostraram que ambos os fungos produzem complexos constituídos por enzimas celulolítica e xilanolítica e outras proteínas, as quais apresentam uma complementariedade funcional no processo de degração de substratos polissacaridícos. Em T. harzianum foram analisados três complexos, os quais apresentaram os seguintes componentes: celobiohidrolase I, celobiohidrolase I-II, alfa-L-arabinofuranosidase, xilana 1,4- -xilosidase (complexo I); acetilxilan esterase, ndoquitinase, arabinogalactana, endo-1,4- -galactosidase, celobiohidrolase I, cutinase, ?-N-arabinofuranosidase e endo- -1,4-xilanase (complexo II); glucoamilase, endo-beta-1,4- glucanase, swollenina, beta-endoglucanase ancorado a GPI, alfa-L-arabinofuranosidase, ?-1,3-glucanase (complexo III). T. reesei produziu mais complexos multi-enzimáticos quando cultivado em meio contendo lactose que galactose. A composição dos complexos I e II em lactose parece torná-los melhores equipados para biodegradação. Os componentes dos complexos do meio com lactose são: glicosil hidrolases 20, 36, beta-1,3-endoglucanase, alfa-alactosidase, exo-beta-1,4-glucanase, aril-alcool oxidase, "predicted protein" 43, "predicted protein" 20 (complexo I); beta-1,3-endoglucanase, "predicted protein" 20, 48, 44, 61, 52, 42, glicosil hidrolase 37, quitinase (complexo II). Os complexos do meio com galactose são: glicosil hidrolases 16, 36, 54, 55, beta-1,3-endoglucanase, catalase/peroxidase bifuncional, "predicted protein" 20 (complexo I); "predicted protein" 20, 44, 61, 52, beta-1,3-endoglucanase, glicosil hidrolase 3, 37, quitinase, amidase (complexo II). Além disso, o complexo I é mais expresso em meio contendo lactose que galactose, ocorrendo inversamente com o complexo II. Juntos, esses dados mostram que a fonte de carbono influi na composição dos complexos multi-enzimáticos em T. reesei. A cooperatividade funcional entre os elementos dos complexos dos fungos são discutidos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Plant cell degrading enzymes produced by microorganisms possess important biotechnological applications; including the production of bioethanol . Some anaerobic bacteria are abl e to produce multienzymatic complexes called cellulosomes whilst filamentous fungi normally secrete individual hydrolytic enzymes that act synergically in the process of polysaccharide degradation. I n the present work we demonstrated that the filamentous fungi Trichoderma harzianum and Trichoderma reesei secrete active multienzymatic complexes when culti vated i n culture media suppl emented with the agricultural residue sugarcane bagasse and lactose (gal actose), respecti vely. The secret ome of bot h f ungi were analysed by 1D-BN (blue native) PAGE. Protein bands corresponding to possible complexes were submitted to electrophoretic separation using a Tricine-SDS system in order to demonstrate that they were constituted by smaller components. Zymogr aphic assays were performed using 1D-BN-PAGE and 2D-BN/BN-PAGE o verify cellulolytic and cellulolytic activities in the complexes. Finally, the complexes were trypsin di gested, subjected to LC-MS/MS and the results analyzed using the soft ware MASCOT and MS-BLAST to identify t hei r component s. The results demonstrated t hat both organisms produced complexes constituted by cellulolytic and xylanolytic enzymes as well as other protei ns relat ed to polysacchari de degradation. Three T. harzianum complexes that were analyzed presented the following components: cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase I-II, al pha-L-arabinofuranosidase, xylan 1,4- - xylosidase (compl ex I); acetilxylan esterase, endochitinase, arabinogalactan, endo-1, 4- -galactosidase, cellobiohydrolase I, cutinase, -N-arabi nofuranosidase e endo- -1,4-xylanase (complex II); glucoamilase, endo-beta-1,4-glucanase, swollenin, GPI-anchored beta-endoglucanase, alpha-L-arabinofuranosi dase and -1,3-glucanase (compl exo III). T. reesei produced more multienzymatic compl exes when grown in lactose than in galactose containi ng medium. The composition of compl exes I and II in lactose possibly make them more suitable for biodegradation. The component s of t he compl exes produced i n t he l act ose medium are: glycosyl hydrolases 20, 36, beta-1,3-endogl ucanase, alpha-gal actosidase, exo-bet a-1, 4-glucanase, aryl - 1, 3- ex II). The compl exes produced in the gal actose medi um are glycosil hydrolases 16, 36, 54, 55, bet a-1, 3- 20, 44, 61, 52, bet a-1, 3-endoglucanase, glycosyl hydrolase 3, 37, chitinase and ami dase (complex II). In addition, compl ex I is more expressed in l actose than in gal actose medium whil e compl ex II is more expressed in galactose. Overall, the dat a show that the carbon source infl uence the composition of T. reesei multienzimatic complexes. The functional cooperativity between the elements of the complexes are discussed.