Construção de um vetor para expressão heteróloga em Pichia pastoris

Abstract

O sistema de expressão Pichia pastoris tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. O objetivo deste estudo foi construir um vetor de expressão em P. pastoris para produção de proteína heteróloga, reunindo elementos genéticos que possibilitem a seleção de transformantes com multicópias integradas, buscando aumentar o nível de expressão. Nesse sentido, foi utilizado o vetor comercial pPICZαA (Invitrogen) que teve seu gene de resistência Sh ble substituído pelo gene kanR, derivado do transposon Tn 903, alterando a resistência ao antibiótico zeocina para o antibiótico G418. Elevadas concentrações deste antibiótico podem ser utilizadas para a seleção de clones com alto número de cópias integradas. Após troca da marca de seleção, foram clonados no vetor um promotor do gene constitutivo glicolítico PGK1 (PPGK1) de P. pastoris, um sinal de secreção fator α de acasalamento de Saccharomyces cerevisiae - com códons otimizados para P. pastoris - e um novo sítio múltiplo de clonagem. Para analisar a capacidade de produzir uma proteína heteróloga, o gene da pró-quimosina B de Bos taurus foi clonado no vetor e mostrou-se capaz de coagular leite no teste de atividade. Novos elementos genéticos podem ser clonados no vetor a fim de aumentar a frequência de integração genômica, como uma porção repetitiva do DNA de P. pastoris - que servirá como alvo da integração - e o gene defectivo leu2-d de S. cerevisiae para uso de marca auxotrófica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Pichia pastoris expression system has been successfully used in the production of a wide variety of heterologous proteins. This yeast combines characteristics such as easy molecular handling, rapid cell growth, capacity to carry out post-translational modifications and efficient secretion. In addition, it can achieve high cell densities with high production of the heterologous protein. The aim of this study was to create a new P. pastoris vector using genetic elements that allow the selection of multicopy transformants aiming to increase heterologous expression. We used the commercial vector pPICZαA (Invitrogen) as a platform to replace the native Sh ble gene by kanR , derived from transposon Tn5, and, thus, changing antibiotic resistance from zeocin to G418. High concentrations of the former antibiotic can be used to select clones with high number of integrated copies. Next, we cloned the promoter of the constitutive glycolytic gene PGK1 (PPGK1) from P. pastoris, the α mating factor signal sequence of Saccharomyces cerevisiae - with codons optimized for P. pastoris - and a new multiple cloning site. To analyze the ability to produce a heterologous protein, the bovine chymosin B was cloned and successfully secreted as judged by milk coagulating test. Furthermore, we began the construction of a new vector based on the auxotrophic leu-2d marker from S. cerevisiae which should enable the selection of multiple events of integration in the genome of a LEU2-null strain of P. pastoris.