Identficação de marcadores moleculares para a competência ovocitária em células do cumulus bovinas

Abstract

As células do cumulus exercem um importante papel durante o crescimento do ovócito, maturação, ovulação e fecundação e, portanto, influenciam a qualidade do ovócito. Com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos em células do cumulus (CC) bovinas foi realizado a análise de microarranjo, utilizando complexos cumulus-ovócitos (COCs) com diferentes graus de competência. Para isso foi utilizado o modelo do tamanho de folículo em que COCs competentes foram recuperados de folículos ?8,1 mm e incompetentes de folículos de 1-3 mm de diâmetro. Nessa análise, foram identificados 4.178 genes diferencialmente expressos (P<0,05) nas duas categorias de CCs. Dentre os genesdiferencialmente expressos utilizou-se um critério de corte adicional em que somente aqueles com 2,5x foldpara mais ou menos foram considerados. Foi, então, gerada uma lista preliminar de 143 genes mais expressos e 80 genes menos expressos em CCs de folículos competentes em relação aos incompetentes, que poderiam possivelmente estar envolvidos com a aquisição da competência ovocitária. Esses genes foram investigados de acordo com suas respectivas funções celulares e a maioria deles foi classificada como relacionados às funções do ciclo celular, ovulação e inflamação, reparo de DNA, metabolismo de energia, metabolismo de aminoácidos, sinalização celular e meiose. Três vias molecularesenvolvendo esses genes foram discutidas. Seis desses genes candidatos a potenciais marcadores (FGF11, IGFBP4, SPRY1, ARHGAP22, COL18A1 e GPC4) foram selecionados para validação por qPCR em células do cumulus obtidas de folículos de 1-3, 6-8 e ?8,1 mm de diâmetro. Dos genes validados, três deles (COL18A1, GPC4 e IGFBP4) confirmaram a expressão diferencial detectada no microarranjo (P<0,05). Entretanto, somente o GPC4 apresentou expressão diferencial entre os folículos mais competentes, 6-8 e ?8,1 mm, em relação aos menos competentes de 1-3 mm, podendo, portanto, ser utilizado como marcador para predizer a competência dos ovócitos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cumulus cells have an important role during oocyte growth, maturation, ovulation and fertilization. Therefore they influence oocyte quality. In an attempt to identify genes differentially expressed in bovine cumulus cells (CC) of different competence, microarray analysis was performed. The model of follicle size in which competent cumulus-oocytecomplexes (COCs) were recovered from follicles > 8.1 mm and incompetent from follicles 1- 3 mm in diameter was used. In this analysis, we identified 4,178 genes differentially expressed (P<0.05) in the two categories of CCs. In addition to P value we set a cut-off value of 2.5 fold change in gene expression for up or down. Based on those criteria a preliminary list was produced with 143 genes up and 80 genes down regulated, respectively, in CCs of competent follicles in relation to incompetent ones. These genes were investigated according to their cellular functions and most of them were classified as related to the cell cycle, ovulation and inflammation. DNA repair, energy metabolism, metabolism of amino acids, cell signaling and meiosis. Three molecular pathways involving these genes were discussed. Six candidate genes (FGF11, IGFBP4, SPRY1, ARHGAP22, and COL18A1 GPC4) were selected for validation by qPCR in cumulus cells of follicles 1-3. 6-8 and > 8.1 mm in diameter. Among the selected genes, three of them (COL18A1, GPC4 and IGFBP4) confirmed the differential expression detected in the microarray (P<0,05). However, only GPC4 showed differential expression between competent follicles, 6-8 and > 8.1 mm when compared to 1-3 mm. These markers can be used to predict oocyte competence.